背景与目的：　　 宫颈癌是发病率最高的女性生殖道恶性肿瘤，其中鳞癌占80％。高危型人乳头瘤病毒(Human Papilloma Virus,HPV)的持续感染被认为是诱导宫颈上皮细胞恶性转化的关键因素。宫颈鳞癌患者多伴有高危型HPV16的感染。HPV感染→非典型增生→原位癌→浸润癌是宫颈鳞癌发展的典型过程，但只有不到1％的感染者最终发展为宫颈鳞癌，说明宫颈鳞癌的形成还与其它因素有关。　　 宫颈鳞癌细胞与其他恶性肿瘤一样，其生物学特性取决于特异表达的基因，而在肿瘤发展过程中必然伴随着不同的基因表达变化。那么调控宫颈鳞癌细胞特异的基因表达及其发展过程中基因表达变化的生物学机制是什么?近年非编码RNA(non-coding RNAs)，特别是微小分子RNA(microRNA,miRNA)调控基因表达研究的兴起给该问题的解决提供了新的线索。miRNAs是一类可调控基因表达的内源性非编码小分子RNA，通过与靶基因mRNA特异的碱基配对结合，引起靶基因mRNA降解或者翻译抑制，引起靶基因沉默。研究表明，miRNAs通过调控肿瘤相关基因的表达，参与发育、造血、器官形成、凋亡、细胞增殖等一系列的重要进程，而在肿瘤的发生和发展中扮演着原癌基因或者抑癌基因的角色。其中，尤以miR-21最为引人关注。　　 miR-21是一种位于17q23.2染色体FRA17B脆性区域上的多顺反子miRNA，大量实验证明在包括结肠癌、乳腺癌、肺癌、肾癌、胃癌、淋巴瘤、白血病等多种肿瘤中miR-21的表达均出现显著异常，提示miR-21作为一个致癌miRNA，在肿瘤的发生和发展中发挥着重要的作用。值得注意的是，miR-21位于染色体脆弱区域FRA17B，而这正是HPV16整合于人染色体17q23.2的区域。HPV整合到人细胞基因组可引起基因改变，如缺失、扩增或重组，和表观遗传改变。因此我们推测在HPV整合部位附近的miR-21可能对宫颈鳞癌的发生和发展有重要作用。　　 尽管肿瘤相关miRNA的发现及其功能的分析已然成为当前研究热点之一，然而在宫颈肿瘤中，特别是以宫颈鳞癌为代表的盆腔鳞状细胞癌的相关miRNA及其功能的研究罕见报道。从宫颈上皮内瘤变(Cervical IntraepithelialNeoplasia，CIN)发展到宫颈鳞癌(Cervical Squamous Cell Carcinoma,SCC)是一个较长的过程，而一旦宫颈鳞癌进展到晚期阶段，治疗往往就棘手了。因此早发现高危型HPV感染、早治疗CIN患者、早诊断宫颈癌患者，是当前医学预防和研究的重点之一。　　 鉴于此，本研究首先采用实时定量RT-PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)和northern blot技术，通过与正常宫颈组织对比，观察CIN和SCC的组织和细胞中miR-21的表达水平；随后在石蜡切片中开展原位杂交检测，观察成熟miR-21的分布，分析miR-21的表达与宫颈鳞癌患者的临床病理因素的相关性。在此基础上，建立体外培养宫颈鳞癌的细胞模型，通过转染miR-21拮抗物，观察细胞增殖、凋亡和迁移能力的改变，进而在裸鼠体内观察转染后宫颈鳞癌细胞成瘤能力的改变。为深入探讨上述作用机制，我们通过cDNA芯片结合靶基因预测软件，筛选出了miR-21可能的靶基因CCL20,并且通过荧光素酶报告基因检测技术加以验证，从而为阐明miR-21在高危型HPV16感染的宫颈鳞状上皮细胞恶性转化过程中的作用提供线索，为研制靶向宫颈鳞癌细胞的miRNA或其靶基因的新型基因药物提供实验依据。　　 第一部分miR-21在HPV16感染的宫颈鳞状上皮病变细胞中的表达　　 研究目的：　　 最近研究报道显示miR-21在多种实体瘤中表达量增高，但关于miR-21在宫颈鳞状上皮不同病变阶段中的研究尚无报道。本部分旨在通过观察miR-21在宫颈鳞状上皮恶变过程的不同阶段的表达情况，从而为宫颈鳞癌的治疗和预防提供新的思路。　　 研究方法：　　 采用qRT-PCR法比较HPV16型阳性的新鲜宫颈上皮瘤变组织与病变周围正常宫颈组织，以及HPV16型阳性的新鲜宫颈鳞癌组织和癌旁组织中miR-21表达量的差异。进而在HPV16型阳性的宫颈鳞癌Caski和Siha细胞株中采用qRT-PCR法及northern blot法观察miR-21的表达。通过石蜡切片的原位杂交法不仅检测miR-21的定位，而且就表达水平结合患者的临床和病理学资料进行统计分析。　　 结论：　　 miR-21在HPV16感染的宫颈上皮瘤变细胞及宫颈鳞癌细胞中高表达，并且表达与病变细胞分化程度以及患者有无淋巴结转移等密切相关。　　 第二部分miR-21调控HPV16型阳性的宫颈鳞癌细胞生物学功能的体外研究　　 研究目的：　　 随着越来越多的miRNAs不断被发现，人们的研究焦点转移到miRNAs的功能研究。功能研究指通过调控miRNA的表达水平，观察细胞生物学特性的改变。本部分通过观察抑制miR-21的表达后，HPV16型阳性的宫颈鳞癌细胞生物学行为的改变，探讨miR-21调控宫颈鳞癌细胞增殖、凋亡、迁移的生物学机制，为研制靶向宫颈鳞癌细胞的miRNA新型基因药物提供实验依据。　　 研究方法：　　 建立体外培养宫颈鳞癌细胞模型，转染miR-21的抑制物，抑制宫颈鳞癌Caski和Siha细胞miR-21的表达，并且以荧光显微镜检测转染效率，以qRT-PCR观察转染后的抑制效率，确定最佳转染条件。抑制miR-21表达后，对Caski和Siha细胞应用MTT法检测增殖能力的变化；应用平板克隆法检测细胞克隆形成能力的改变：应用Hoechst和流式细胞仪检测细胞凋亡的改变；应用transwell小室和划痕实验检测细胞迁移能力的改变。　　 结论：　　 miR-21与宫颈鳞癌细胞的增殖、凋亡、迁移等生物学行为相关。　　 第三部分miR-21调控HPV16型阳性的宫颈鳞癌细胞生物学功能的体内研究　　 研究目的：　　 时间和空间特异性使miRNA的体内研究显得尤为重要。本部分应用裸鼠体内成瘤实验观察miR-21下调表达后Siha细胞体内成瘤能力的改变，对体外实验的结果进一步验证。　　 研究方法：　　 裸鼠皮下分别接种转染miR-21的抑制物和阴性对照的Siha细胞，定期观察成瘤状况，监测成瘤体积，5周后处死行HE染色检测肿瘤性质，TUNEL法观察不同肿瘤细胞的凋亡情况。　　 结论：　　 抑制miR-21表达后，Siha细胞体内成瘤能力明显降低，凋亡增多。　　 第四部分miR-21靶向CCL20参与宫颈鳞状上皮细胞恶性转化　　 研究目的：　　 miRNA对细胞表型的作用，通常是通过负性调控其特定的靶基因，影响基因功能来实现的。因此，要阐明miR-21在宫颈鳞癌细胞中的作用机制，就需要寻找miR-21发挥作用的靶基因。我们综合基因芯片数据和生物信息数据库预测结果，缩小靶基因的搜寻范围，确定CCL20基因为miR-21候选的功能性靶基因。初步探讨宫颈鳞癌细胞中miR-21以CCL20作为靶点的作用机制。　　 研究方法：　　 1、利用22K Human Genome Array，筛选抑制miR-21表达后宫颈鳞癌细胞中mRNA差异表达的基因。应用qRT-PCR验证芯片结果。　　 2、利用基于miRNA与靶基因作用方式算法的靶基因预测软件，包括miRanda，Targetscan，miRBase对miR-21的靶基因进行预测。　　 3、挑选芯片结果中上调表达倍数最大并且为上述三种预测软件所共同预测的基因CCL20作为miR-21可能的靶基因检测。采用荧光素酶报告基因检测系统检测。　　 4、利用半定量RT-PCR检测miR-21功能被抑制后CCL20的mRNA水平的改变。　　 5、利用IF技术、Westem blot技术和Elisa技术分别检测miR-21功能被抑制后CCL20蛋白水平的改变。　　 结论：　　 CCL20可能是miR-21在宫颈鳞癌细胞恶性转化过程中的靶基因。　　 本研究的主要结论　　 1、miR-21在宫颈鳞癌细胞表达明显升高，并且与临床生物学特性相关。　　 2、miR-21参与调控宫颈鳞癌细胞的增殖、凋亡及迁移等生物学行为。　　 3、miR-21可能通过靶向CCL20参与宫颈鳞状上皮细胞恶性转化。