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前列腺癌严重威胁广大男性的生命健康,目前前列腺癌去势抗性已成为临床治疗的重大难题。因此,根据前列腺癌的生物学特点寻找新的抗癌靶点对前列腺癌的治疗具有重要意义。研究报道正常前列腺上皮细胞主要以糖酵解供能,而前列腺癌细胞则主要以氧化磷酸化为细胞提供能量。线粒体作为氧化磷酸化的主要场所,其在前列腺癌细胞中含量丰富。本研究旨在确定以线粒体为核心的治疗靶点,为研发新抗癌药物提供重要理论依据。线粒体功能的维持依赖于细胞内线粒体质量控制,线粒体质量控制包括:线粒体生物合成、线粒体分裂融合和线粒体自噬。研究表明过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子-1α(PGC-1α)作为线粒体功能的主要调节因子,它可在细胞核内与多种具有组蛋白乙酰基转移酶活性的转录因子相互结合,从而调控线粒体生物合成、线粒体分裂融合等细胞过程。核呼吸因子(NRF1)是PGC-1α下游的主要转录因子,它可以通过激活线粒体相关转录因子(TFAM)促进线粒体基因拷贝。PGC-1α/NRF1/TFAM信号通路是线粒体生物合成的经典途径,是细胞内线粒体的主要来源。此外,有研究报道运动后人肌肉中的PGC1-α可转录促进线粒体融合蛋白Mfn2的表达;在小鼠出生后心脏发育过程中,PGC1-α能够转录促进线粒体融合蛋白Mfn1的表达。再者,PGC1-α还可以参与调控线粒体分裂蛋白DRP1。PGC-1α通过调控线粒体生物合成和分裂融合以维持正常的线粒体功能。据报道,与正常前列腺上皮细胞相比,前列腺癌细胞中PGC-1α高表达,并通过激活雄激素受体(AR)促进前列腺癌细胞的生长。但前列腺癌细胞中PGC-1α对线粒体功能的调控是否发挥促癌作用仍有待探讨。肿瘤抑制因子p53是经典的抑癌因子,包括前列腺癌细胞(如:PC3和DU145)在内的50%以上的肿瘤细胞中存在p53的突变或缺失。近几年,p53对肿瘤细胞代谢的调控作用引起科学家们的高度关注。人们发现在多数肿瘤细胞中p53通过抑制Warburg效应,促进氧化磷酸化发挥抑癌作用。但在以氧化磷酸化为主要能量来源的前列腺癌细胞中p53干预能量代谢,影响肿瘤细胞存活的作用机制有待进一步研究。综上所述,前列腺癌细胞的三大生物学特点包括:(1)线粒体含量丰富并以氧化磷酸化供能;(2)PGC-1α高表达;(3)多数肿瘤细胞存在p53突变或缺失。PGC-1α是维持线粒体功能的重要保障,p53与PGC-1α或线粒体功能是否存在相互关联?多项实验研究已经证实在p53突变或缺失的肿瘤细胞中PGC-1α高表达,并发挥促癌作用。如:Ogasawara MA等发现p53缺失的慢淋白血病细胞中高表达的PGC-1α可维持细胞正常的线粒体功能;此外,R72位点突变型p53可增强PGC-1α的功能,促进肿瘤的代谢和转移。可见p53的缺失或突变是导致PGC-1α功能增强的主要原因。有研究报道,p53可损伤Hep G2细胞的线粒体功能,但其详细机制并未阐明。鉴于上述研究背景,p53-PGC-1α途径可能参与调控线粒体功能。本研究为证实p53缺失是导致PGC-1α高表达,线粒体功能增强的主要原因,利用瞬时转染技术将外源性p53转入p53缺失的前列腺癌PC3细胞中,应用细胞实验观察p53对前列腺癌PC3细胞线粒体功能的影响,并检测PGC-1α以及其下游线粒体生物合成和分裂融合相关蛋白的表达,最后检测p53/PGC-1α途径对细胞凋亡的影响。方法:(1)Western blot和间接免疫荧光技术检测前列腺癌PC3细胞p53的转染效率。(2)OCR检测p53对前列腺癌PC3细胞氧消耗率的影响;Mitotracker-RED染色检测p53对前列腺癌PC3细胞线粒体量的影响。(3)Western blot检测p53对前列腺癌PC3细胞PGC-1α蛋白表达的影响;间接免疫荧光法检测p53对前列腺癌PC3细胞PGC-1α核定位的影响;MTT法检测PGC-1α激活剂ZLN005对前列腺癌PC3细胞存活率的影响;Western blot检测ZLN005对前列腺癌PC3细胞PGC-1α蛋白表达的影响;OCR检测ZLN005对各组细胞氧消耗率的影响;Mitotracker-RED染色检测ZLN005对各组细胞内线粒体量的影响。(4)Q-PCR检测各组细胞PGC-1α下游参与调控线粒体生物合成和线粒体分裂融合的相关基因的表达;Western blot检测各组细胞PGC-1α下游参与线粒体生物合成和线粒体分裂融合的相关蛋白的表达;(5)流式细胞术检测细胞凋亡;Western blot检测凋亡相关蛋白的表达。结果:(1)与阴性对照组(nc)相比,p53组成功过表达p53,其转染效率达70%。(2)与阴性对照组(nc),p53组细胞氧气消耗率降低,线粒体量下降。(3)与阴性对照组(nc),p53组PGC-1α的蛋白表达降低,核定位减少;ZLN005应用的最佳剂量为15u M;与p53组相比,ZLN005+p53组细胞氧气消耗率增加,线粒体量提高。(4)与p53组相比,ZLN005+p53组线粒体生物合成和线粒体分裂融合相关基因表达增加,各基因对应的蛋白高表达。(5)与p53组相比,ZLN005+p53组细胞凋亡率降低,凋亡相关蛋白表达下降。结论:p53通过抑制PGC-1α降低线粒体生物合成和分裂融合相关蛋白表达,导致线粒体功能障碍,引起细胞凋亡。