手足口病（hand-food-mouth disease,HFMD）是由小RNA病毒科肠道病毒属引起的急性肠道传染病,随着对其临床特征及致病机制研究的不断深入可知:EV-A71引起的普通HFMD在临床症状等方面与柯萨奇病毒A组16型（Coxsackievirus A 16,CV-A16）及其他肠道病毒（other enterovirus,other EV）引起的HFMD难以区别,且多种肠道病毒均有重症病例的报道。目前对于重症病例的治疗以对症治疗为主,且尚无特效的抗病毒药物及安全有效的疫苗可应用于人群。因此,HFMD的预防控制策略重心主要在于传染源的控制和切断传播途径。随着人口流动性的加大,疾病传播速度的加快,传统的流行病学危险因素分析已难以实现对该病的完全防控,所以分析其临床流行病学及分子遗传进化对该病的防控显得尤为重要。此外,对疾病的预防亦离不开对其发病机制的探讨。就目前而言,对重症HFMD患儿发病机制的研究成效甚微。我们知道,病毒感染细胞的第一步是与受体结合,而目前EV-A71究竟通过何种受体入胞尚不清楚;此外,蛋白质组学的快速发展为研究病毒性疾病的发病机制、早期诊断及靶蛋白的发现提供了可能。本研究以河南省郑州市儿童医院2013-2015年HFMD高发时段（4月⁶月）77例重症HFMD患儿为病例组,以同期77例轻症HFMD患儿为对照组,对患者的临床特征及实验室指标进行分析,采用秩和检验对实验室指标进行初步筛选,结合判别分析筛选重症HFMD患儿的实验室预测指标,为重症HFMD的早期识别、临床干预和治疗提供新的方法和指标,为该病的防控提供科学依据;在此基础上,对2013年²015年HFMD高发时段的主要病原进行遗传进化分析;此外,本研究筛选出EV-A71敏感神经胶质细胞系,在此基础上研究EV-A71感染宿主免疫细胞后对Toll样（Toll-like receptors,TLRs）受体、炎症因子及炎症小体相关基因、神经生长因子（Nerve growth factor,NGF）及其受体相关基因表达的影响及差异蛋白质学,以期进一步了解HFMD发生机制,为探索有效的防治措施提供依据。目的1筛选重症HFMD的实验室预警指标,为该病的早期识别和临床干预提供依据,为机制的探讨指明方向。2阐明河南地区2013-2015年HFMD流行高峰期主要病原的VP1基因特征,为我省疫情监测和防治提供依据。3初步了解EV-A71病毒感染星形胶质细胞后TLRs、炎症因子、炎症小体、NGF及其受体相关基因的表达变化,探讨EV-A71可能的嗜神经机制。4初步了解EV-A71病毒感染星形胶质细胞后的差异蛋白组学,为EV-A71的嗜神经机制提供可能的蛋白靶点。方法1研究设计、调查员培训及预调查;正式调查及质量控制;统计分析。2粪便样品的采集与保存;根据HFMD实验室手册进行粪便样品的处理;根据QIAamp Viral RNA Mini Kit试剂盒说明书提取病毒RNA;严格按照硕世（2+1）试剂盒进行肠道病毒荧光RT-PCR检测;用RD细胞进行EV-A71及CV-A16病毒分离;RT-PCR扩增EV-A71及CV-A16 VP1基因;1.5%琼脂糖凝胶进行基因扩增产物的检测并测序;生物信息学分析。3常规RD细胞培养;EV-A71毒株的制备与定量;EV-A71感染U87细胞模型的建立及病变发生时间的确定;收集细胞及细胞RNA提取;实时荧光定量PCR检测目的基因。4选取对数生长期的U87细胞进行实验;根据预实验确定最佳感染时间,之后收集细胞提取蛋白;样品浓度测定;每份样品各取5μL,进行SDS-PAGE检测;蛋白预处理;蛋白样品色谱质谱检测,获得原始质谱数据。结果1重症HFMD实验室预警指标的筛选单因素分析显示:与轻症组患儿相比,重症组WBC、PLT、PCT、MCV、MCH、LCR、SCR、LCC、GLO、CK-MB、K、S100和B细胞的水平较高（P<0.05）,而重症组MCR、EOR、BASOR、SCC、MCC、EO、BASO、NA、CL、T、Th和Th/Ts的水平较低（P<0.05）。判别分析筛选出5个重症预测指标:MCR、LCC、Th、CK-MB和CL。逐一回代法的分类符合率为0.799;交互验证的分类符合率为0.779。2 HFMD病原基因特征24株EV-A71河南分离株之间的核苷酸同源性为93.0%¹00.0%,氨基酸同源性96.6%¹00.0%。将此24株河南EV-A71病毒分离株VP1序列与已知各基因型、基因亚型代表株进行同源性比较,结果显示:24株EV-A71河南分离株与A、B1、B2、B3、B4、B5基因型代表株VP1核苷酸同源性依次为82.2%⁸3.8%、82.9%⁸4.1%、83.0%⁸4.3%、82.9%⁸4.7%、82.6%⁸4.0%、82.3%⁸3.9%;与C基因亚型C1、C2、C3、C5代表株的核苷酸同源性为88.2%⁹0.3%、87.5%⁸9.5%、86.6%⁸8.5%、86.1%⁸9.6%;与C4b基因亚型核苷酸同源性为89.5%⁹1.5%;与C4a基因亚型核苷酸同源性为95.3%⁹7.9%。与CV-A16的同源性最低,仅为62.0%⁶3.4%;用MEGA6.0软件对2013²015年分离的24株EV-A71病毒VP1基因序列与取自GenBank的31株EV-A71各基因型、基因亚型代表株及1株CV-A16 G-10国际标准株进行遗传进化分析可知,24株EV-A71河南分离株均与C4亚型代表株处于同一分支,属于C4基因亚型,2013²015年24株EV-A71河南分离株为C4a亚群。24株CV-A16河南分离株之间的核苷酸同源性为88.5%⁹9.6%,氨基酸同源性为98.6%¹00.0%。24株河南分离株与G10国际标准株（U05876）的核苷酸同源性为75.4%⁷7.2%;与B1a代表株的核苷酸同源性为91.4%⁹3.8%;与B1b代表株的核苷酸同源性为88.4%⁹6.5%;与B1c代表株的核苷酸同源性为91.4%⁹3.1%;与B2代表株的核苷酸同源性为88.5%⁹0.6%。与EV-A71代表株的核苷酸同源性最低,仅为65.3%⁶6.4%。用MEGA 6.0软件对24株CV-A16河南分离株VP1基因序列与取自GenBank的12株基因型、基因亚型代表株及1株EV-A71国际标准株进行系统进化分析可知,24株CV-A16河南分离株分别与B1a和B1b亚型代表株处于同一分支。3 EV-A71感染U87细胞后相关基因的差异表达TLR1-9 mRNA的表达:实时荧光定量RT-PCR结果提示:EV-A71感染后各时间点两组TLR1 mRNA的表达差异无统计学意义（P>0.05）;EV-A71感染后6h TLR2 mRNA高表达（P<0.05）,其余各时间点两组TLR2 mRNA的表达差异无统计学意义（P>0.05）;EV-A71感染后8h TLR3 mRNA低表达（P<0.05）,其余各时间点两组TLR3 mRNA的表达差异无统计学意义（P>0.05）;EV-A71感染后TLR6各时间点差异均无统计学意义（P>0.05）。炎症小体相关基因的表达:实时荧光定量RT-PCR结果提示:与对照组相比,EV-A71感染后8h及10h IL-1β升高（P<0.05）,其余时间点差异均无统计学意义（P>0.05）;与对照组相比,EV-A71感染后8h及10h NLRP3升高（P<0.05）,其余时间点差异均无统计学意义（P>0.05）。炎症因子相关基因的表达:实时荧光定量RT-PCR结果提示:EV-A71感染后6h、8h、10h IL-6 mRNA均高于对照组（P<0.05）,呈时间依赖性;EV-A71感染后6h、8h、10h IL-8 mRNA均高于对照组（P<0.05）,亦呈时间依赖性。NGF及其相关受体基因的表达:实时荧光定量RT-PCR结果提示:EV-A71感染后2⁶h NGF mRNA的表达差异无统计学意义（P>0.05）,之后两组表达差异有统计学意义（P<0.05）,并呈现时间依赖性,提示在EV-A71感染后期NGF mRNA表达量下降。脑源性神经营养因子（Brain-derived neurotrophic factor,BDNF）在各时间点两组表达差异均无统计学意义（P>0.05）;低亲和力受体p75^NTR在EV-A71感染后8h mRNA的表达达高峰（P<0.05）,其余时间点两组表达差异无统计学意义（P>0.05）;而高亲和力受体TrkA mRNA有时检测不到,而检测到的部分荧光Ct值达40以上,提示TrkA在EV-A71感染后可能被抑制。4 EV-A71感染U87细胞后相关蛋白的差异表达EV-A71感染组与对照组相比,共鉴定出差异蛋白31个,其中上调蛋白9个（PIAS1、MRC2、TNPO2、PMM2、ZNFX1、APPL2、EDF1、RPA1、MYO5A）,下调蛋白22个（NUDT21、PDCD6、CDKN1A、TRIM41、MRPL18、PRKCSH、KPNA6、ASL、RPL35、RBM42、UACA、ABHD10、AXL、S100A10、XRN1、NAPG、GORASP2、UTP6、SUCLG1、EIF3M、SYAP1、AP3D1）。对31种差异表达蛋白的GO注释分析结果显示:CC包括细胞内、细胞外基质、膜蛋白等6种;差异表达蛋白所涉及的BP主要涉及的过程是细胞代谢;差异蛋白涉及多项分子功能,主要包括蛋白结合、核苷酸结合、催化活性、结构分子活性等。通过KEGG pathway通路对31个差异蛋白进行检索,这些蛋白共可以参与到25个信号转导通路中,其中匹配率最高的是代谢通路和三羧酸循环等。结论1 DA可用于重症HFMD的实验室指标筛选。2 2013²015年河南省HFMD高发期所流行的EV-A71毒株均属C4a亚型;所流行的CV-A16毒株以B1b基因亚型为主,辅以B1a基因亚型。3 TLR2/TLR3可能在EV-A71感染后的免疫应答中起重要作用;IL-6、IL-8及炎症小体可能参与EV-A71感染后的神经免疫应答;NGF、p75^NTR、TrkA可能在EV-A71的嗜神经机制中有着重要作用。4定量分析证实EV-A71感染U87细胞后有31个蛋白质表达差异有统计学意义,这些差异蛋白可为研究EV-A71病毒的嗜神经机制提供新的线索。