第一部分:3D打印设备辅助下“一针法”袖套式肝动脉重建在大鼠原位肝移植中的应用目的:大鼠肝移植模型是研究肝脏缺血再灌注损伤、肝移植术后免疫应答最常用的动物模型,但受限于技术水平,过去很长时间内无动脉吻合的肝移植模型广被推崇。然而无动脉吻合的肝移植术后胆道并发症发生率较高,而且会出现肝脏微环境、免疫状态的改变等,逐渐让研究者意识到动脉吻合重要性。“袖套法”动脉吻合是大鼠肝移植动脉重建最常用的方法,基于此技术的种种改良都因动脉重建后返流性出血以及远期血管通畅率低等均未被广泛推广。而究其原因,可能与供、受体动脉直径不匹配及血管重叠部分不足有关。本研究旨在探索并验证一种简易、高效的“一针法”袖套式动脉重建,探讨供受、体动脉的选择策略,吻合的技术要点,进一步探讨改良的动脉吻合方法的远、近期通畅率及术后生存率,是构建稳定的动脉化大鼠肝移植模型的一种大胆尝试。方法:我们选用Dark Agouti（DA）和Lewis（LEW）纯种系大鼠作为研究对象,首先使用标准参照物和高清图片,Image J测量大鼠的肝总动脉、肝固有动脉直径。在经典“双套管”大鼠原位肝移植模型的基础之上进行改良,使用3D打印的套管和辅助套管安装设备,以无动脉重建的大鼠肝移植作为对照,在不同的供、受体组合中实施并验证改良的“一针法”袖套式动脉重建的效果。我们选择肝总动脉作（CHA）为供体血管进行重建,受体供血动脉则依据供肝动脉的直径进行选择,可以选择肝总动脉或肝固有动脉（PHA）。重建的方式仅由一针引导线将供受体血管固定,通过外翻动脉的方式获得足够的动脉重叠长度,达到有效降低返流性出血。结果:LEW和DA大鼠在相近的周龄下,LEW大鼠CHA直径（0.749±0.04mm）为DA大鼠（0.328±0.032mm）的2倍,肝总动脉的直径为相应肝固有动脉的两倍。动脉重建组（n=35）肝移植手术总时间为113.5±5.67min（median,SD）,无肝期12.18±1.49min,动脉重建耗时5.11±1.05min,各步骤耗时少于文献报道平均时间。在不同供受体组合上进行验证动脉吻合的效果,供肝血管均选择肝总动脉,受体动脉根据供肝动脉的直径选择与之匹配的肝总动脉或肝固有动脉进行吻合,经剖腹探查验证动脉长期通畅性达到96%。动脉重建组长期存活率为89.3%,明显高于无动脉重建组的57.14%。另外,动脉重建组大鼠术后体重及肝功能恢复更快,多时间节点上的组织病理学表现上与正常肝脏无明显差异。结论:经过练习,3D打印的套管及安装设备可以大幅度降低无肝期的耗时,降低大鼠肝移植的手术难度和耗时。这种改良的“一针法”袖套式动脉重建方式操作简单、符合生理状态,具有通畅性高、耗时短、有效的避免返流性出血。选择合适的供、受体动脉,保证其口径的相对匹配可以降低吻合难度,而足够长的血管重叠则是避免返流性出血、保证动脉吻合质量、降低远期并发症的关键。第二部分:单细胞转录组学揭示不同种属大鼠肝脏巨噬细胞表达和功能差异目的:大鼠肝移植术后的免疫应答具有显著的种属差异性,有些种属的大鼠接受移植肝后可以自发性免疫耐受,有些则会发生急性排斥反应,而其内在机制尚未明确。DA大鼠肝脏移植到LEW大鼠体内会诱发致死性排斥反应,而供受体反过来则会出现自发性免疫耐受,为全面绘制肝脏细胞谱图并构建基于不同种系大鼠的肝脏移植实验模型,我们使用单细胞RNA测序技术分析DA和LEW健康大鼠肝脏单细胞悬液,通过比较两者的肝脏细胞图谱,旨在揭示导致大鼠种系间特异性排斥反应的内在机制,为移植术急性排斥反应的诊治提供新的思路。方法:我们使用改良的“两步法”胶原酶灌注消化大鼠肝脏,制备高质量肝脏单细胞悬液,使用10×Genomics进行DA大鼠和LEW大鼠肝脏的单细胞转录组测序并进行后续数据分析。为了避免技术偏倚并发现关键差异性表达,我们开发了一个使用矩阵分解的分析流程,称为Varimax PCA,这项新的算法能帮助我们发现不同细胞的特异性标识及种属差异性表达,进而深入分析解读。然后对差异性表达显著的巨噬细胞进行功能鉴定及体外实验验证。结果:基于Varimax的分析流程有助于大鼠肝脏单细胞图谱绘制及细胞种群的注释,可以特异性识别DA及LEW大鼠种系差异表达的细胞及分子基础。通过这种方法,我们识别并进一步分析了具有种属特异性的巨噬细胞亚群及肝细胞亚群的分子及细胞学标记。对于巨噬细胞相关因子的阐述进一步明确了LEW大鼠巨噬细胞中丰富的促炎因子及信号,这表明与DA大鼠相比,LEW大鼠肝脏微环境更具有更显著的促炎性作用。结论:综上所述,我们首次绘制了健康LEW和DA大鼠肝脏的肝脏细胞及肝内免疫细胞的单细胞转录图谱,揭示了不同种系间肝脏细胞及免疫细胞差异表达的基因。不同种属的肝脏巨噬细胞功能表型的差异有可能揭示不同供受、体组合预后差异的潜在机制。第三部分:肝脏巨噬细胞在肝移植术后急性排斥反应中的作用目的:明确肝移植术后急性排斥反应中的细胞及分子机制可为进一步改善临床诊治及评估方案提供理论基础。探索有效可行的免疫耐受的诱导方法,并寻找能有效评估免疫耐受程度的生物学标志物,从而降低免疫抑制剂的用量,改善患者生活质量并延长生存时间,已经成为临床肝移植领域最迫切的需要攻克的难关。前面单细胞测序数据表明LEW较DA大鼠肝内巨噬细胞具有更显著促炎性表型,我们进一步研究肝移植术后早期肝脏巨噬细胞在表现和功能上的变化,有助于揭示急性排斥反应和免疫耐受中的关键通路。方法:我们用改良的“一针法”袖套式动脉重建的大鼠肝移植模型,将DA大鼠供肝植入LEW大鼠体内,构建稳定的致死性急性排斥反应模型。进而通过体外实验进行评估和验证,在移植术后不同时间节点使用免疫组化和流式细胞分析的方法研究肝移植术后急性排斥反应的免疫细胞浸润及程度,并对LEW和DA大鼠肝内巨噬细胞进行体外的功能验证和分析。结果:我们通过体外LPS刺激实验和细胞内细胞因子染色定量分析局势细胞炎症反应的实验对上述结果进行功能验证,研究发现与DA相比,在LPS刺激下,LEW肝内巨噬细胞（CD45+CD68+CD11b+）分泌TNF-α显著增多。DA-LEW肝移植（ACR组）术后转氨酶进行性升高、排斥反应活性指数（RAI）显著升高及组织学上明确的肝细胞、胆管上皮细胞损伤,平均存活12天,验证了DA-LEW肝移植是稳定急性排斥反应模型。流式细胞分析和免疫组织化学染色均提示肝移植术后7天内无论ACR组还是对照组都会出现CD3,CD8和CD68的染色阳性细胞,尤其以实验组表现出CD3+,CD8+和CD68+细胞在组织和细胞悬液中浸润进行性加重。值得注意的是,随着急性排斥反应的进展,ACR组肝脏巨噬细胞CD86表达显著下调。结论:LEW大鼠与DA大鼠相比,肝内巨噬细胞具有更显著的促炎性作用。LEWLEW肝移植术后会出现肝内CD3+,CD8+,CD68+细胞浸润,而DA-LEW肝移植后发生急性排斥反应,这些细胞浸润程度会随着病程进行性加重,继发肝脏损伤,最终造成受体死亡,而肝内巨噬细胞表型的变化可能是诱导发生急性排斥反应的一个因素。