异丙基丙烯酰胺接枝的温敏材料的合成、表征与无损收获贴附型细胞

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背景及目的:再生医学是一种细胞治疗途径,包括组织工程和细胞移植。它可以用来再生受损或者缺失的组织,以及治疗多种难治的疾病。为了再生人类组织替代原先受损的组织,需要约109~1011个治疗细胞,这些细胞包括多能干细胞和体细胞细胞。但是,培养中反复使用胰蛋白酶对细胞进行消化,这对细胞膜蛋白以及细胞外基质都有一定程度的损伤,导致细胞活力的降低。如果能将一种温敏材料接枝到平皿或者微球表面,合成一种支持细胞生长同时可以非侵袭性温敏收获的温敏材料,那对细胞培养将有很大的应用价值。异丙基丙烯酰胺(Poly(N-isopropylacrylamide),PNIPAAm)是一个非常合适的温度敏感的材料。在细胞培养箱中,这种材料是疏水性的,细胞可以在材料表面贴附生长;当温度降低到20℃,NIPAAm转变成亲水性材料,细胞将会从材料表面脱落,从而非侵袭地收获细胞。  方法:温敏平板:化学合成PS-NIPAAm共聚物,将PS-NIPAAm共聚物倾倒到PS平板的表面。红外检测NIPAAm接枝情况,接触角检测表面的亲疏水性。接种干细胞检测温敏平板的细胞贴附和脱附能力,并检测收获干细胞的活力和分化能力。  温敏微载体:原子转移自由基聚合法(Atom transfer radical polymerization,ATRP)合成温敏聚苯乙烯微球CMPS-NIPAAm,可逆加成-断裂链转移聚合(Reversible Addition-Fragmentation Chain Transfer Polymerization,RAFT)法合成温敏葡聚糖微球G-50-NIPAAm。SEM、AFM检测微球表面形貌,XPS检测微球表面元素含量变化。接种VER O细胞到温敏微球上,检验细胞的贴附和脱附能力;转瓶中检测细胞在微球上的增殖能力并考察温敏材料在长期培养细胞中脱附率的变化情况。  结果:温敏平板实验:红外光谱法显示温敏平板上1550 c m-1和1648 c m-1处有氨基和羰基吸收峰,而普通平板上没有,NIPAAm成功接枝到平皿表面。在37℃时,温敏平皿的接触角在75.3°~85.0°范围内,和普通平皿的85.5°接近,都呈现疏水性。但是当温度降到20℃。细胞实验中,温敏平板的细胞贴附率和普通平皿相当,细胞脱附率在60%左右。温敏收获的干细胞也具有明显的成脂成骨分化能力。  温敏微载体实验:微球扫描电子显微镜检测显示,相比于普通的微球,温敏微球表面有比较明显的褶皱。而X-射线光电子能谱检测显示,温敏材料表面的N元素含量相比未接枝微球有一定增加,这表明NIPAAm接枝成功。细胞实验中,温敏微球有和普通微球相当的细胞贴附率和大约53%的细胞脱附率,同时在转瓶中细胞能在微球上稳定地生长,并保持约120 h培养时间内50%左右的细胞脱附率。
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