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以燕窝中特有成分.燕窝糖蛋白为检测目标,建立了双抗夹心酶联免疫方法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测燕窝糖蛋白,为燕窝鉴伪提供有效方法。抗原是影响抗体特异性和效价的重要因素。燕窝经60℃水浴提取、醇析得糖蛋白粗品,再经DEAE-Sepharose fast flow离子交换层析、Sephacryl S-200凝胶过滤层析分离纯化得到了成分相对均一的燕窝特征组分燕窝糖蛋白,经SDS-PAGE凝胶电泳测定其分子量约为60 kD,且为单一条带,再次说明成分相对均一;通过β消去反应,证明O型糖肽键的存在,证明所得组分为糖蛋白。以纯化的糖蛋白免疫日本大耳白兔,获得了兔抗燕窝糖蛋白抗血清,效价达到64000,采用Protein A-Sepharose 4B亲和层析纯化的抗体作为第一抗体,其浓度为3.09mg/mL,以常用的辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)标记抗体得到酶标抗体,经条件优化建立了抗体-抗原-酶标抗体的双抗夹心ELISA方法,其检测限为0.031μg/mL,线性范围为0.0625-2μg/mL。选用常见的燕窝掺假物银耳、猪皮、淀粉、鸡卵清蛋白以及凝集素、牛血清蛋白(BSA)等常见蛋白类物质进行交叉反应实验,结果抗体和待测物的交叉反应率很低,表明所建立方法特异性强。采用60℃水浴提取3-4 h,残渣重复提取一次,合并两次提取液,过滤、离心。上清液经PBS缓冲液稀释,稀释液用双抗夹心ELISA法检测并绘制样品稀释曲线,比较稀释曲线和标准曲线,结果表明样品稀释曲线与标准曲线基本平行,说明建立的双抗夹心ELISA方法可以准确地测定燕窝样品提取液。采用建立的燕窝样品糖蛋白检测方法测得白燕样品提取液浓度为558μg/mL。结合交叉反应实验结果,说明该方法可以有效用于燕窝掺假的鉴别。