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染色体区域稳定蛋白1(CRM1)也称为核输出蛋白1(XPO1),是治疗人类肿瘤的一个有前途的靶点。CRM1在胃癌、卵巢癌、胰腺癌、骨肉瘤、胶质母细胞瘤和宫颈癌等肿瘤组织中表达过高,且与预后不良有关。目前,尚不清楚CRM1是否参与了人胃癌的病理生理过程,以及靶向抑制CRM1是否能成为治疗胃癌的新型治疗方式。近年来,许多研究表明CRM1抑制剂都具有α,β-不饱和δ-内酯环,包括Leptomycin B、Ratjadone等化合物。在本课题中,我们探讨了M-5对胃癌细胞的抗肿瘤作用以及其可能的机制。主要结果如下:1.用MTT法检测M-5对两种胃癌细胞(MGC803和HGC27)和胃正常上皮细胞(GES1)的抗增殖活性。我们发现M-5以浓度依赖的方式抑制两种胃癌细胞(MGC803和HGC27)的增殖,但对胃正常上皮细胞(GES1)基本上无细胞毒性。2.为了证实线粒体在M-5诱导细胞凋亡中所发挥的作用,使用JC-1检测线粒体膜电位。结果表明,M-5使MGC803和HGC27细胞中的线粒体膜电位下降。蛋白质免疫印迹法分析表明,在胃癌细胞中加入M-5,会引起Bax水平升高,同时Bcl-2和Bcl-xL水平降低,随后Caspase-9和Caspase-3也被激活,导致线粒体介导的凋亡。3.为了确定M-5通过ROS来诱导细胞凋亡,利用DCFH-DA的流式细胞术分析显示M-5在MGC803细胞中以时间依赖的方式增加细胞内ROS水平。免疫沉淀结果显示与Keap1结合的Nrf2在6 h显著降低。在加入M-5处理6 h后,细胞质和细胞核蛋白的检测以及免疫荧光显示Nrf2在细胞核中累积增加。这些研究结果表明,M-5诱导ROS产生和激活keap1/Nrf2通路来抵抗ROS的损伤,尽管Keap1/Nrf2通路的激活并没有阻断M-5介导的细胞凋亡。4.为了进一步阐明ROS在M-5诱导细胞凋亡中的作用,我们用NAC预处理MGC803和HGC27细胞1 h,然后与M-5共同孵育24 h。结果表明NAC预处理后,明显抑制了M-5诱导的MGC803和HGC27细胞凋亡。此外,数据显示,NAC预处理后,在胃癌细胞中M-5调控的凋亡相关蛋白、CRM1和p53的变化几乎完全被阻断。这些研究结果表明,ROS的激活在M-5诱导的两种胃癌细胞中发生凋亡是必不可少的。5.CRM1识别靶蛋白的核输出信号(NES),介导p53的核输出。p53是一种众所周知的抑癌基因,被认为是细胞命运最关键的调节因子之一,有趣的是,p53定位在很大程度上依赖于CRM1的运输。为了探讨在胃癌细胞中M-5诱导的线粒体凋亡通路与p53有关,蛋白质免疫印迹法显示在MGC803和HGC27细胞中CRM1水平降低,p53水平升高。免疫共沉淀结果显示,在MGC803细胞中加入M-5后,CRM1与p53的结合明显降低。通过免疫荧光显示,在M-5处理后,Ranbp1和p53在细胞核中明显累积。此外,用p53 siRNA转染MGC803细胞后,M-5诱导的细胞死亡率明显下降。这些结果表明,M-5对CRM1的降解导致p53表达量增加,并且p53是M-5诱导线粒体介导的凋亡所必需的。6.MG132或其他蛋白酶体抑制剂对晚期胃癌或其它实体瘤的抗肿瘤活性极低,这些结果表明蛋白酶体抑制剂与其他抗肿瘤药物的联合应用在预防和治疗癌症方面具有广阔的前景。在本研究中,MG132和M-5对MGC803和HGC27细胞表现出协同杀伤作用。MTT实验表明用MG132预处理能显著增加MGC803和HGC27细胞的凋亡,而单独用M-5或MG132处理只能轻微或根本不降低细胞存活率。此外,数据显示用MG132预处理能增加两种胃癌细胞中的Cleaved PARP,Cleaved caspase-3,p53和Bax蛋白的表达量。在MG132或Bortezomib存在下,M-5对CRM1蛋白的降解几乎完全被阻断。免疫沉淀结果表明p53转移至细胞质中并与抗凋亡Bcl家族蛋白Bcl-2和Bcl-xL结合。这些数据表明,M-5诱导的CRM1蛋白降解需要通过泛素-蛋白酶体途径,M-5与MG132联合作用能增加细胞凋亡。