论文部分内容阅读
随着生活水平提高，糖尿病（Diabetes Mellitus，DM）发病率呈逐年上升趋势。而近年来研究证明成体干细胞对治疗糖尿病动物模型具有良好效果，为临床治疗DM提供了一种新的治疗手段。经血源性子宫内膜干细胞（Menstrual blood-derived Endometrial Stem Cells，MenSCs）因其来源丰富、免疫原性低、多向分化潜能高且无致瘤性等特点受到关注。而目前常规MenSCs的分离提取需借助淋巴细胞分离液，分离成本较高，分离时间较长，因此本实验通过直接裂解法优化MenSCs提取效率、提高样本使用效率，并有效缩短提取时间；进一步通过优化现有糖尿病动物模型方法，建立高效、稳定的糖尿病大鼠模型，为深入研究MenSCs在糖尿病临床治疗中的潜在作用机制提供可靠的技术支持。 第一部分 Ⅱ型糖尿病大鼠模型的建立与评价 目的：1.明确少量多次注射链脲佐菌素（STZ）及高脂饮食对大鼠Ⅱ型糖尿病模型的构建及稳定性的影响，从而为建立高成功率、稳定的大鼠Ⅱ型糖尿病模型提供借鉴。 2.通过分析临床糖尿病患者血生化指标，进一步佐证本实验所建立Ⅱ型糖尿病大鼠模型与人类糖尿病患者的相似性。 方法：1.连续4周给予雄性SD大鼠特殊高脂饮食诱导胰岛素抵抗，分别在d28、d35、d42给予腹腔注射浓度为30mg/kg的STZ，继续高脂饮食喂养至d49天，将高脂饮食喂养大鼠组随机分为高脂饮食组和正常饮食组。检测各组大鼠血糖、空腹血糖和糖耐量的变化，进一步检测各组胰岛素、血脂、肝肾功能的生理生化指标，评价模型构建的效果及稳定性。 2.收集临床糖尿病患者血生化等相关资料利用SPSS11.0软件作统计分析。 结果：1.STZ连续注射三周后，高脂饮食饲养组大鼠全部达到糖尿病诊断标准，而持续高脂饮食饲养组糖尿病症状稳定，且肝、肾功能受损情况逐渐加重；但d49天更换正常饮食饲养组大鼠各项指标均发生显著变化，血糖、血脂及肝、肾功能指标趋近于对照组大鼠。 2.通过统计分析，证明本实验所建立Ⅱ型糖尿病大鼠模型生化指标与临床糖尿病患者血生化指标基本吻合。 结论：通过高脂饮食饲养结合连续三周给予三次小剂量腹腔注射STZ可成功建立Ⅱ型糖尿病大鼠模型，而持续高脂饮食饲养可保持动物模型的稳定性，以及结合临床资料分析，进一步证明本实验所建立Ⅱ型糖尿病大鼠模型接近于临床患者发病症状，为探究糖尿病发病机制的基础研究提供可靠的动物模型。 第二部分 经血源性子宫内膜干细胞的分离方法优化 目的：选用健康女性经血作为材料，分别利用传统的密度梯度离心法和红细胞裂解法提取MenSCs，比较两种方法的分离时间和分离效率，为建立一种MenSCs分离提取时间的高效性以及提高样本的极大利用率的方法。 方法：在月经周期的前几天，健康女性志愿者利用月经杯（Divacup）采集经血样本30ml，并在同等条件下分为A组及B组，每组15ml，于4℃条件下保存，在48h内进行原代细胞分离提取。A组样品离心后，加入6-10倍细胞体的红细胞裂解液裂解沉淀中的红细胞，收集细胞沉淀，接种于细胞培养瓶中；B组样品常规方法提取，密度梯度离心后，收集白膜层，PBS洗涤后，接种于细胞培养瓶中。MTT法和流式细胞仪检测两种方法分离的MenSCs第3、9和18代（P3、P9、及P18代）细胞增殖活性及成体干细胞表面标志物表达情况，并对比两种方法分离时间及分离效率的差异。 结果：两种不同的方法分离培养的MenSCs均阳性表达成体干细胞表面标志物CD29、CD44、CD73、CD90、CD105，阴性表达造血干细胞表面标志物CD45和CD34，同时阳性表达HLA-ABC，阴性表达HLA-DR；且两种不同方法分离培养的MenSCs在增殖活性上无统计学差异。但红细胞裂解法比传统的密度梯度离心法分离时间更短，分离效率更高。 结论：两种MenSCs分离培养方法均满足成体干细胞的鉴定标准，且在生物学特性上未见显著差异，但红细胞裂解法提取细胞成本低，效率高，可为MenSCs的基础及临床研究节约时间及成本。