论文部分内容阅读
背景、目的：卵巢癌因早期临床表现不明显,缺乏有效的早期筛查的方法,当诊断时多已发展至晚期。尽管卵巢癌的肿瘤减灭术及以铂类、紫杉醇的联合化疗有效的提高了卵巢癌的预后,仍有约70%的患者在2年内复发,而这些Ⅲ/Ⅳ期复发的患者5年生存率仅为23%。因此,新的、有效的治疗卵巢癌的方法十分急需。本研究为明确内源性血管生成抑制因子vasohibin-1对人卵巢癌SKOV-3细胞体外增殖和凋亡能力的影响,以期为卵巢癌的治疗提供新的思路。方法：细胞培养,SKOV-3细胞用含10%胎牛血清、100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的RPMI-1640培养液培养,培养瓶置于37℃、5%C02培养箱中,细胞呈单层贴壁生长,选用对数生长期细胞进行实验。(1)以不同的病毒感染复数(multiplicity of infection,MOI),即MOI=25、50、75、100,用重组腺病毒vasohibin-1(Ad-vasohibin-1)感染SKOV-3细胞,于荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况及细胞形态,绿色荧光消失的时间,计算感染率,确定病毒最佳MOI；(2)当MOI=50、75、100,用Ad-vasohibin-1感染SKOV-3细胞,分别于感染后24h及48h,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况并拍照。(3)按所确定的最佳MOI,MOI=75,用Ad-vasohibin-1感染SKOV-3细胞,采用蛋白质印迹法(Western Blot)检测SKOV-3细胞内vasohibin-1蛋白的表达水平；(4)利用Cell Count Kit-8(CCK-8)检测Ad-vasohibin-1对SKOV-3细胞增殖的影响,取不同的MOI,即MOI=25、50、100、200,分别培养24h、48h和72h。(5)利用Hoechst33258检测Ad-vasohibin-1对SKOV-3细胞凋亡的影响。结果：(1)MOI=25、50、75、100,病毒感染SKOV-3细胞24h,可以观察到绿色荧光；48h荧光达到最亮,且随着MOI值增大绿色荧光增强,MOI=100时,部分细胞出现较明显的死亡；荧光持续10天消失；(2)MOI=50、75、100,病毒感染SKOV-3细胞,见绿色荧光强度随感染时间延长和MOI增大而增强；(3)经腺病毒感染48h后,SKOV-3细胞中vasohibin-1蛋白表达量与对照组相比,显著性增加(P<0.05)；(4)CCK-8检测发现vasohibin-1重组腺病毒对SKOV-3细胞增殖具有抑制作用,MOI=25时vasohibin-1重组腺病毒感染SKOV-3细胞24h,与对照组相比,没有统计学差异(P=0.065)；余各组间相比均具有统计学意义(P<0.05),且抑制能力随MOI增大而增加(P<0.05),随时间的延长而增加(P<0.05)。(5)Hoechst33258染色观察到Ad组的SKOV-3细胞较NC组及BC组细胞核体积缩小,染色质浓染,亮度明显增强,核碎裂,呈致密的颗粒状或块状,出现较多的核固缩和碎裂。结论：Vasohibin-1可以在SKOV-3细胞中过表达,其过表达能够抑制SKOV-3细胞的增殖能力,并具有浓度和时间依赖性,同时能诱导SKOV-3细胞的凋亡,可为卵巢癌的治疗提供新思路。