T细胞是人体适应性免疫系统中的重要组成部分,在病原体感染、恶性肿瘤以及自身免疫疾病中扮演着关键性作用。T细胞受体TCR是表达于T细胞表面的抗原受体,通过识别结合有抗原肽的组织相容性复合物p MHC来启动T细胞介导的免疫应答。但是TCR本身不具备信号传导的功能,而是通过其共受体CD3信号分子进行下游的信号传递,TCR与CD3共受体之间通过非共价连接形成TCR-CD3复合物。TCR-CD3复合物中包括抗原识别受体TCRαβ二聚体以及由CD3γε、CD3δε、CD3ζζ二聚体组成的CD3信号分子。TCR在识别并结合特定p MHC后能够引起TCR信号通路的激活,经过一系列的信号传导引起激活蛋白1(AP-1),核转录因子κB(NF-κB)以及T细胞激活核因子(NFAT)等转录因子表达的上升。这些信号传递最终可以引起T细胞激活、增殖、产生细胞因子以及对感染了病原体的细胞进行杀伤。在近二十年中,提出了多种TCR-CD3信号的激活模型,但是其具体的激活机制并不清楚。同时有大量关于TCR-CD3复合物胞外区域的结构研究,但是TCR-CD3复合物整体是如何进行组装,复合物中各个亚基的化学计量比以及信号传递过程中是否发生了构象的变化等关键问题仍未得到解决。本研究中首先解决了TCR-CD3复合物难以表达、纯化得到均一稳定的复合物等难题,从人源c DNA文库中扩增得到组成TCR-CD3复合物的6个亚基全长基因序列,TCRα、β亚基之间通过E2A短肽连接并克隆至p CAG载体,CD3共受体的各个亚基通过P2A短肽连接并克隆至pc DNA3.4载体。利用哺乳动物细胞表达体系对组成TCR-CD3复合物的6种亚基进行共表达,筛选得到表达量高且具有生物活性的TCR-CD3复合物,利用链霉亲和素标签进行蛋白纯化,使用免疫印迹实验对各个亚基进行验证。通过化学交联剂戊二醛对TCR-CD3复合物进行交联,负染样品观察结果显示戊二醛交联后的TCR-CD3复合物颗粒大小均一,而未交联的TCR-CD3复合物的颗粒不均一,说明该复合物发生了解聚。戊二醛交联对于TCR-CD3复合物的热稳定性以及结合特异抗体的亲和力未产生影响,意味着戊二醛交联后的TCR-CD3复合物构象未发生变化,所以使用戊二醛交联后的TCR-CD3复合物进行冷冻电镜数据的收集。本研究通过冷冻电镜技术解析了包括全部8个亚基的人源TCR-CD3复合物3.7?分辨率的三维结构。结构中包括TCR-CD3复合物完整的胞外区以及跨膜区,整体结构呈现冰淇淋甜筒形状。三维结构显示TCR-CD3复合物中各个亚基的化学计量比为TCRαβ:CD3γε:CD3δε:CD3ζζ=1:1:1:1。TCR-CD3复合物胞外区相互作用由各个亚基的恒定区以及连接短肽所介导,TCRαβ二聚体的恒定区同时与CD3γε、CD3δε二聚体存在相互作用,同时CD3δε、CD3γε二聚体之间也存在相互作用,胞外区整体呈现类似三次对称结构,TCRβ亚基处于中心位置。各个亚基近膜区的连接短肽之间形成二硫键,对于维持TCR-CD3复合物构象的稳定起到了重要作用。TCR-CD3复合物的跨膜区形成由8个跨膜螺旋组成的桶状结构,TCRαβ亚基的跨膜螺旋位于筒状结构的中心位置,各个跨膜螺旋之间通过大量的疏水作用以及静电相互作用形成稳定的结构,两条CD3ζ链的跨膜区分别与CD3δε、CD3γε的跨膜区相结合。通过将TCR-CD3复合物结构与p MHC-TCRαβ、OKT3-CD3γε复合物结构比对可以发现p MHC、OKT3同TCRCD3复合物的结合并未引起成明显的结构变化,并且二者所结合的位置完全不同,同时发现了OKT3与TCR-CD3复合物的潜在作用位点。综上所述,本研究通过解析TCR-CD3复合物的高分辨率三维结构,对TCRCD3复合物的组装机制有了深度的理解,并且对解释TCR与配体结合后如何启动免疫应答的分子机制提供了关键信息,对基于TCR-CD3复合物的免疫疗法开发提供了结构基础。