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骨关节炎(Osteoarthritis，OA)是一种因内源性再生能力有限而无法有效治疗的退行性关节疾病，是中老年人常见的致残原因。随着人口老龄化现象的加剧，OA的发病率逐年增高，已经发展成为一个突出的社会问题。据预测，到2020年，美国25%的成年人口将受到这一疾病的影响，OA给个人、家庭和社会带来了严重的负担。OA的病因和发病机制尚待阐明，临床治疗效果不好。一般认为软骨细胞，软骨下骨和细胞外基质合成和降解的失衡是导致OA发生的重要原因。
目前临床上OA的治疗方法主要包括使用止痛药、非甾体抗炎药、关节损伤处添加润滑补充剂，以及在骨关节炎晚期运用关节置换外科手术等方法。然而这些方法只能减轻骨关节炎病人的疼痛和暂缓OA进程，并不能逆转因关节软骨不可逆退变而引起的OA病程。近年来，利用间充质干细胞(Mesenchymal stem cell， MSCs)对骨关节炎和其它关节病理过程中的关节软骨退化和损伤进行了大量的研究，取得了明显进展，具有较好的应用前景。
MSCs具有较强的自我更新、增殖和多谱系分化能力，可以在体内诱导分化成软骨、成骨、脂肪等多种成体细胞，这为MSCs治疗OA提供了可能。人脐带源间充质干细胞(Human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells，hUC-MSCs)是MSCs的一种重要细胞来源，因其低免疫原性、强大的体外扩增能力并可以通过向软骨分化从而修复损伤的软骨组织而被大量研究。诱导多能干细胞来源的间充质干细胞(Pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells，iPSC-MSCs)是一种新型干细胞，具有比传统干细胞具有更有效、更可靠的再生能力，并且可以通过诱导产生大量功能均一的MSCs。诱导多能干细胞提取物(Pluripotent stem cell-extract，iPSC-extract)是iPSC的细胞提取物，是将iPSC裂解后提纯的产物，包括外泌体及细胞内容物等。本研究通过建立大鼠实验性骨关节模型，比较不同来源间充质干细胞对骨关节炎的治疗作用并设置了剂量差异组。
目的：
通过手术法建立大鼠实验性骨关节炎模型，关节腔内注射hUC-MSCs、iPSC-MSCs和iPSC-extract，探讨不同来源MSCs对OA的治疗作用以及剂量差异性。
方法：
采用Hulth法建立大鼠OA模型，模型动物随机分为六组，分别为模型组、hUC-MSCs(2.0×106，5.0×106cell/ml)组、iPSC-MSCs(2.0×106cell/ml)组、iPSC提取物组(iPSC-extract，2.0×106cell/ml)、玻璃酸钠(HA，10 mg/ml)阳性对照组，每组10只，另设假手术组作为对照。造模12周后开始给药，除HA组需多次给药(每周一次，给药5次)外，其他各组均单次给药，每次每只动物在术侧关节腔注射50μl药物，假手术组和模型组同法给予生理盐水。给药5周后测量大鼠手术侧和非手术侧关节直径差值；X线检查手术侧关节腔结构，并进行Kellgren-Lawrence评分；手术显微镜观察手术侧股骨髁和胫骨平台关节面结构并进行Pelletier评分；HE染色法进行手术侧膝关节病理检查并按照Mankin评分标准评分；免疫组化法检测手术侧膝关节MMP-13、CollagenⅡ及ADAMTS-5表达情况；蛋白芯片法检测手术侧膝关节腔液中炎性因子表达。
结果：
1.不同来源MSCs对OA大鼠膝关节直径差值的影响
处死大鼠后，用游标卡尺对大鼠手术侧和非手术侧膝关节直径进行测量。结果显示，与假手术组相比，模型组大鼠膝关节直径差值显著增高，提示OA模型诱导成功；与模型组相比，hUC-MSCs(2.0×106，5.0×106cell/50μl)及iPSC-MSCs(2.0×106cell/50μl)给药能够明显降低膝关节直径差值，iPSC-extract(2.0×106cell/50μl)组无统计学意义，给药各组间无差异性。
2.不同来源MSCs对OA大鼠膝关节X线评分的影响
处死大鼠前，用3%戊巴比妥钠麻醉大鼠后行X线检查。结果显示，与假手术组相比，模型组大鼠X线评分明显增高、关节严重度及严重度动物数量均显著升高；与模型组相比，iPSC-MSCs(2.0×106cell/50μl)给药可降低大鼠膝关节X线评分等级和严重度(3、4级)OA动物数量，改善关节腔结构、减少骨赘形成和骨质硬化作用，其他给药组在降低X线评分等级方面无显著差异。
3.不同来源MSCs对OA大鼠膝关节Pelletier评分的影响
处死大鼠后，解剖大鼠手术侧膝关节。结果显示，与假设手术组相比，模型组大鼠膝关节面Pelletier评分显著升高；与模型组相比，各给药组均可以明显降低Pelletier评分，且iPSC-MSCs(2.0×106cell/50μl)组降低Pelletier评分较hUC-MSCs(2.0×106cell/50μl)给药组有显著差异，hUC-MSCs给药未显示出剂量差异。
4.不同来源MSCs对OA大鼠膝关节病理的影响
处死大鼠后，留取大鼠膝关节股骨髁内踝关节面进行病理检查。结果显示，假手术组大鼠关节骨组织正常，病理评分较低，模型组大鼠软骨边缘部分缺损，软骨排列紊乱，病理评分显著高于模型组；与模型组相比，各给药组均可以显著改善关节病结构，降低病理评分等级，其中iPSC-MSCs(2.0×106cell/50μl)组在降低病理评分较hUC-MSCs(2.0×106cell/50μl)给药组有显著差异，hUC-MSCs给药未显示出剂量差异。
5.不同来源MSCs对OA大鼠膝关节中CollagenⅡ、MMP-13、ADAMTS-5表达的影响
免疫组化结果显示，与假手术组相比，模型组大鼠软骨层中Ⅱ型胶原损失严重，表达显著减少；与模型组相比，各细胞治疗组可以显著增加软骨细胞中Ⅱ型胶原表达，其中高剂量组hUC-MSCs(5.0×106cell/50μl)在增加软骨细胞中Ⅱ型胶原表达较低剂量组hUC-MSCs(2.0×106cell/50μl)给药有显著差异，提示hUC-MSCs给药存在剂量差异；使用相同细胞数量情况下，相比于hUC-MSCs及iPSC-extract给药组，iPSC-MSCs给药在增加软骨细胞中Ⅱ型胶原表达较有显著性差异。
MMP-13免疫组化染色结果显示，模型组大鼠关节软骨中表达明显升高，各给药组均可显著降低MMP-13的表达。与低剂量hUC-MSCs相比，hUC-MSCs高剂量组在降低MMP-13表达水平上有显著性差异；使用相同细胞数量情况下，相比于hUC-MSCs和iPSC-extract组，iPSC-MSCs给药可以显著降低软骨细胞中MMP-13的表达；其中hUC-MSCs(2.0×106cell/50μl)下调软骨细胞中MMP-13表达较iPSC-extract(2.0×106cell/50μl)有显著性差异；
ADAMTS-5免疫组化染色结果显示，与假手术组相比，模型组大鼠关节软骨细胞中ADAMTS-5表达显著增加；与模型组相比，除iPSC-extract(2.0×106cell/50μl)组外，其余各细胞给药组能够显著降低大鼠关节软骨中ADAMTS-5的表达；其中高剂量hUC-MSCs给药降低大鼠软骨中ADAMTS-5水平明显优于低剂量hUC-MSCs给药组；使用相同细胞数量给药，iPSC-MSCs给药在下调关节软骨细胞中ADAMTS-5表达较hUC-MSCs和iPSC-extract给药组有显著性差异。
6.不同来源MSCs对大鼠膝骨关节炎模型中炎性因子水平的影响
对大鼠膝关节腔内炎性因子TNF-α检测结果表明，相比于假手术组，模型组大鼠关节腔内TNF-α水平显著升高，与模型组相比，各细胞给药组可显著降低炎性因子TNF-α表达，其中高剂量hUC-MSCs组在降低炎性因子TNF-α水平较低剂量组有显著性差异，不同来源细胞给药组间在降低炎性因子TNF-α表达水平无显著差异；对大鼠膝关节腔内炎性因子IL-6检测结果表明，相比于假手术组，模型组大鼠关节腔内IL-6水平显著上升，相比于模型组，除低剂量hUC-MSCs组外，各细胞给药组均可以显著降低炎性因子IL-6表达，且在使用相同细胞数量情况下，iPSC-MSCs给药较hUC-MSCs组在降低IL-6水平上有显著性差异；对关节腔液中炎性因子L-selectin检测结果显示，相比与假手术组，模型组大鼠关节腔液中L-selectin表达显著升高，与模型组相比，各细胞给药组可显著降低L-selectin表达水平，其中，不同来源细胞给药组中hUC-MSCs在降低炎性因子L-selectin表达水平明显不如iPSC-MSCs和iPSC-extract给药组，不同剂量hUC-MSCs组间无显著性差异；对关节腔液中细胞因子TIMP-1表达水平检测结果显示，相比于假手术组，模型组大鼠关节腔液中TIMP-1水平显著高于假手术组，相比于模型组，除低剂量hUC-MSCs组外，各细胞给药组均可以显著降低炎性因子TIMP-1的表达，不同来源细胞给药组间iPSC-extract组在降低TIMP-1水平上较hUC-MSCs和iPSC-MSCs有显著差异，其中与iPSC-MSCs组比，hUC-MSCs降低TIMP-1水平明显不及iPSC-MSCs组；关节腔液中抗炎因子IL-10表达水平结果显示，相比于假手术组，模型组中IL-10水平明显降低，与假手术组相比，除高剂量hUC-MSCs外，各细胞给药组均可以显著升高IL-10表达水平，组间没有显著性差异。
7.hUC-MSCs对OA患者软骨细胞中aggrecan、sox-9mRNA表达水平的影响
IL-1β(10ng/ml)体外刺激OA患者软骨细胞48h后，可以抑制OA患者软骨细胞标志基因aggrecan、sox-9mRNA表达水平，促进软骨细胞凋亡。与hUC-MSCs共培养48h后，可以显著增加软骨细胞标志基因aggrecan、sox-9mRNA表达水平，提示hUC-MSCs可以促进OA患者内源性软骨的再生。
8.hUC-MSCs对OA患者软骨细胞中GAGs含量变化的影响
IL-1β(10ng/ml)体外刺激OA患者软骨细胞48h后，可以显著增加释放进培养液中的GAGs含量，与hUC-MSCs共培养48h后，培养液中GAGs含量显著降低，提示hUC-MSCs可以通过抑制基质的降解而保护软骨细胞。
结论：
1.Hulth手术法成功建立实验性大鼠骨关节炎模型，关节腔内注射不同来源MSCs均可有效改善大鼠关节软骨损伤和关节病理。
2.不同来源的MSCs对OA大鼠的疗效存在一定差异：iPSC-MSCs较hUC-MSCs在降低Pelletier评分、关节肿胀和调节细胞因子水平方面具有一定的优势；hUC-MSCs在促进软骨基质合成、抑制其降解方面具有剂量依赖性。
3.hUC-MSCs抑制软骨细胞基质的降解，保护软骨细胞与增加软骨细胞标志基因SOX-9、aggrecanmRNA表达、促进Ⅱ型胶原再生有关。
目前临床上OA的治疗方法主要包括使用止痛药、非甾体抗炎药、关节损伤处添加润滑补充剂，以及在骨关节炎晚期运用关节置换外科手术等方法。然而这些方法只能减轻骨关节炎病人的疼痛和暂缓OA进程，并不能逆转因关节软骨不可逆退变而引起的OA病程。近年来，利用间充质干细胞(Mesenchymal stem cell， MSCs)对骨关节炎和其它关节病理过程中的关节软骨退化和损伤进行了大量的研究，取得了明显进展，具有较好的应用前景。
MSCs具有较强的自我更新、增殖和多谱系分化能力，可以在体内诱导分化成软骨、成骨、脂肪等多种成体细胞，这为MSCs治疗OA提供了可能。人脐带源间充质干细胞(Human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells，hUC-MSCs)是MSCs的一种重要细胞来源，因其低免疫原性、强大的体外扩增能力并可以通过向软骨分化从而修复损伤的软骨组织而被大量研究。诱导多能干细胞来源的间充质干细胞(Pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells，iPSC-MSCs)是一种新型干细胞，具有比传统干细胞具有更有效、更可靠的再生能力，并且可以通过诱导产生大量功能均一的MSCs。诱导多能干细胞提取物(Pluripotent stem cell-extract，iPSC-extract)是iPSC的细胞提取物，是将iPSC裂解后提纯的产物，包括外泌体及细胞内容物等。本研究通过建立大鼠实验性骨关节模型，比较不同来源间充质干细胞对骨关节炎的治疗作用并设置了剂量差异组。
目的：
通过手术法建立大鼠实验性骨关节炎模型，关节腔内注射hUC-MSCs、iPSC-MSCs和iPSC-extract，探讨不同来源MSCs对OA的治疗作用以及剂量差异性。
方法：
采用Hulth法建立大鼠OA模型，模型动物随机分为六组，分别为模型组、hUC-MSCs(2.0×106，5.0×106cell/ml)组、iPSC-MSCs(2.0×106cell/ml)组、iPSC提取物组(iPSC-extract，2.0×106cell/ml)、玻璃酸钠(HA，10 mg/ml)阳性对照组，每组10只，另设假手术组作为对照。造模12周后开始给药，除HA组需多次给药(每周一次，给药5次)外，其他各组均单次给药，每次每只动物在术侧关节腔注射50μl药物，假手术组和模型组同法给予生理盐水。给药5周后测量大鼠手术侧和非手术侧关节直径差值；X线检查手术侧关节腔结构，并进行Kellgren-Lawrence评分；手术显微镜观察手术侧股骨髁和胫骨平台关节面结构并进行Pelletier评分；HE染色法进行手术侧膝关节病理检查并按照Mankin评分标准评分；免疫组化法检测手术侧膝关节MMP-13、CollagenⅡ及ADAMTS-5表达情况；蛋白芯片法检测手术侧膝关节腔液中炎性因子表达。
结果：
1.不同来源MSCs对OA大鼠膝关节直径差值的影响
处死大鼠后，用游标卡尺对大鼠手术侧和非手术侧膝关节直径进行测量。结果显示，与假手术组相比，模型组大鼠膝关节直径差值显著增高，提示OA模型诱导成功；与模型组相比，hUC-MSCs(2.0×106，5.0×106cell/50μl)及iPSC-MSCs(2.0×106cell/50μl)给药能够明显降低膝关节直径差值，iPSC-extract(2.0×106cell/50μl)组无统计学意义，给药各组间无差异性。
2.不同来源MSCs对OA大鼠膝关节X线评分的影响
处死大鼠前，用3%戊巴比妥钠麻醉大鼠后行X线检查。结果显示，与假手术组相比，模型组大鼠X线评分明显增高、关节严重度及严重度动物数量均显著升高；与模型组相比，iPSC-MSCs(2.0×106cell/50μl)给药可降低大鼠膝关节X线评分等级和严重度(3、4级)OA动物数量，改善关节腔结构、减少骨赘形成和骨质硬化作用，其他给药组在降低X线评分等级方面无显著差异。
3.不同来源MSCs对OA大鼠膝关节Pelletier评分的影响
处死大鼠后，解剖大鼠手术侧膝关节。结果显示，与假设手术组相比，模型组大鼠膝关节面Pelletier评分显著升高；与模型组相比，各给药组均可以明显降低Pelletier评分，且iPSC-MSCs(2.0×106cell/50μl)组降低Pelletier评分较hUC-MSCs(2.0×106cell/50μl)给药组有显著差异，hUC-MSCs给药未显示出剂量差异。
4.不同来源MSCs对OA大鼠膝关节病理的影响
处死大鼠后，留取大鼠膝关节股骨髁内踝关节面进行病理检查。结果显示，假手术组大鼠关节骨组织正常，病理评分较低，模型组大鼠软骨边缘部分缺损，软骨排列紊乱，病理评分显著高于模型组；与模型组相比，各给药组均可以显著改善关节病结构，降低病理评分等级，其中iPSC-MSCs(2.0×106cell/50μl)组在降低病理评分较hUC-MSCs(2.0×106cell/50μl)给药组有显著差异，hUC-MSCs给药未显示出剂量差异。
5.不同来源MSCs对OA大鼠膝关节中CollagenⅡ、MMP-13、ADAMTS-5表达的影响
免疫组化结果显示，与假手术组相比，模型组大鼠软骨层中Ⅱ型胶原损失严重，表达显著减少；与模型组相比，各细胞治疗组可以显著增加软骨细胞中Ⅱ型胶原表达，其中高剂量组hUC-MSCs(5.0×106cell/50μl)在增加软骨细胞中Ⅱ型胶原表达较低剂量组hUC-MSCs(2.0×106cell/50μl)给药有显著差异，提示hUC-MSCs给药存在剂量差异；使用相同细胞数量情况下，相比于hUC-MSCs及iPSC-extract给药组，iPSC-MSCs给药在增加软骨细胞中Ⅱ型胶原表达较有显著性差异。
MMP-13免疫组化染色结果显示，模型组大鼠关节软骨中表达明显升高，各给药组均可显著降低MMP-13的表达。与低剂量hUC-MSCs相比，hUC-MSCs高剂量组在降低MMP-13表达水平上有显著性差异；使用相同细胞数量情况下，相比于hUC-MSCs和iPSC-extract组，iPSC-MSCs给药可以显著降低软骨细胞中MMP-13的表达；其中hUC-MSCs(2.0×106cell/50μl)下调软骨细胞中MMP-13表达较iPSC-extract(2.0×106cell/50μl)有显著性差异；
ADAMTS-5免疫组化染色结果显示，与假手术组相比，模型组大鼠关节软骨细胞中ADAMTS-5表达显著增加；与模型组相比，除iPSC-extract(2.0×106cell/50μl)组外，其余各细胞给药组能够显著降低大鼠关节软骨中ADAMTS-5的表达；其中高剂量hUC-MSCs给药降低大鼠软骨中ADAMTS-5水平明显优于低剂量hUC-MSCs给药组；使用相同细胞数量给药，iPSC-MSCs给药在下调关节软骨细胞中ADAMTS-5表达较hUC-MSCs和iPSC-extract给药组有显著性差异。
6.不同来源MSCs对大鼠膝骨关节炎模型中炎性因子水平的影响
对大鼠膝关节腔内炎性因子TNF-α检测结果表明，相比于假手术组，模型组大鼠关节腔内TNF-α水平显著升高，与模型组相比，各细胞给药组可显著降低炎性因子TNF-α表达，其中高剂量hUC-MSCs组在降低炎性因子TNF-α水平较低剂量组有显著性差异，不同来源细胞给药组间在降低炎性因子TNF-α表达水平无显著差异；对大鼠膝关节腔内炎性因子IL-6检测结果表明，相比于假手术组，模型组大鼠关节腔内IL-6水平显著上升，相比于模型组，除低剂量hUC-MSCs组外，各细胞给药组均可以显著降低炎性因子IL-6表达，且在使用相同细胞数量情况下，iPSC-MSCs给药较hUC-MSCs组在降低IL-6水平上有显著性差异；对关节腔液中炎性因子L-selectin检测结果显示，相比与假手术组，模型组大鼠关节腔液中L-selectin表达显著升高，与模型组相比，各细胞给药组可显著降低L-selectin表达水平，其中，不同来源细胞给药组中hUC-MSCs在降低炎性因子L-selectin表达水平明显不如iPSC-MSCs和iPSC-extract给药组，不同剂量hUC-MSCs组间无显著性差异；对关节腔液中细胞因子TIMP-1表达水平检测结果显示，相比于假手术组，模型组大鼠关节腔液中TIMP-1水平显著高于假手术组，相比于模型组，除低剂量hUC-MSCs组外，各细胞给药组均可以显著降低炎性因子TIMP-1的表达，不同来源细胞给药组间iPSC-extract组在降低TIMP-1水平上较hUC-MSCs和iPSC-MSCs有显著差异，其中与iPSC-MSCs组比，hUC-MSCs降低TIMP-1水平明显不及iPSC-MSCs组；关节腔液中抗炎因子IL-10表达水平结果显示，相比于假手术组，模型组中IL-10水平明显降低，与假手术组相比，除高剂量hUC-MSCs外，各细胞给药组均可以显著升高IL-10表达水平，组间没有显著性差异。
7.hUC-MSCs对OA患者软骨细胞中aggrecan、sox-9mRNA表达水平的影响
IL-1β(10ng/ml)体外刺激OA患者软骨细胞48h后，可以抑制OA患者软骨细胞标志基因aggrecan、sox-9mRNA表达水平，促进软骨细胞凋亡。与hUC-MSCs共培养48h后，可以显著增加软骨细胞标志基因aggrecan、sox-9mRNA表达水平，提示hUC-MSCs可以促进OA患者内源性软骨的再生。
8.hUC-MSCs对OA患者软骨细胞中GAGs含量变化的影响
IL-1β(10ng/ml)体外刺激OA患者软骨细胞48h后，可以显著增加释放进培养液中的GAGs含量，与hUC-MSCs共培养48h后，培养液中GAGs含量显著降低，提示hUC-MSCs可以通过抑制基质的降解而保护软骨细胞。
结论：
1.Hulth手术法成功建立实验性大鼠骨关节炎模型，关节腔内注射不同来源MSCs均可有效改善大鼠关节软骨损伤和关节病理。
2.不同来源的MSCs对OA大鼠的疗效存在一定差异：iPSC-MSCs较hUC-MSCs在降低Pelletier评分、关节肿胀和调节细胞因子水平方面具有一定的优势；hUC-MSCs在促进软骨基质合成、抑制其降解方面具有剂量依赖性。
3.hUC-MSCs抑制软骨细胞基质的降解，保护软骨细胞与增加软骨细胞标志基因SOX-9、aggrecanmRNA表达、促进Ⅱ型胶原再生有关。