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胰腺癌是死亡率最高的恶性肿瘤之一,目前临床多种治疗措施未能显著延长胰腺癌患者生存期。深入了解胰腺癌细胞增殖、生长、程序性细胞死亡、迁移等异常生物学行为及其分子机制,是寻找更有效的肿瘤干预措施、提高胰腺癌治疗效果的重要手段。近年来研究发现自噬现象与肿瘤关系密切,多种抑癌基因可诱导自噬。诱导或抑制自噬都可能成为有效的肿瘤治疗措施,但需要根据肿瘤发展的不同阶段、不同的肿瘤类型选择诱导或抑制自噬。ARHI基因是1999年发现的一个母源性印迹基因,是Ras超家族成员之一,也是小分子G蛋白的一种,但GTP酶活性低。其编码的蛋白在人类多种组织中表达。与大部分Ras家族成员是癌基因和促生长调控因子不同,研究证实ARHI基因在卵巢癌和乳腺癌中是抑癌基因,可以抑制肿瘤细胞增殖和迁移,过表达可促进细胞凋亡。新近研究发现,抑癌基因ARHI近似生理水平再表达可诱导多种人卵巢癌细胞系自噬性细胞死亡,而不是凋亡。我们实验室的前期研究表明,ARHI基因在胰腺癌组织中也发挥抑癌基因的作用。通过瞬时和稳定转染将ARHI基因导入该基因表达缺失的胰腺癌细胞,发现ARHI抑制胰腺癌细胞系的增殖,诱导胰腺癌细胞死亡,稳定转染ARHI可导致胰腺癌细胞周期停滞。ARHI是否诱导胰腺癌细胞自噬目前尚未见报道,本课题在前期研究的基础上探讨ARHI基因瞬时表达是否诱导胰腺癌细胞系PANC-1发生自噬,并初步探讨其可能机制。一、抑癌基因ARHI对胰腺癌细胞系PANC-1自噬的影响目的：探讨ARHI基因再表达是否促进胰腺癌细胞系PANC-1自噬方法：应用本实验室构建的携带ARHI基因编码序列的pIRES2-EGFP-ARHI质粒,采用脂质体法瞬时转染胰腺癌细胞系PANC-1,用荧光显微镜及流式细胞术验证转染效率,用RT-PCR及western blot验证ARHI基因转录及翻译水平表达情况；采用Hoechst33258染色观察凋亡细胞形态,PI染色流式细胞术检测细胞凋亡率；应用吖啶橙染色观察细胞内嗜酸性自噬溶酶体,透射电镜观察细胞内具有双层膜结构的自噬体。结果：1)瞬时转染48小时ARHI组PANC-1细胞可见ARHI基因mRNA表达,而空载体组及正常PANC-1细胞组无ARHI mRNA表达。ARHI组瞬时转染后48小时和72小时可见ARHI蛋白表达,空载体组无ARHI蛋白表达；2)转染后120小时Hoechst33258染色ARHI组及空载体组均可见凋亡细胞核及凋亡小体,正常PANC-1细胞未见明显凋亡征象；3)转染后120小时PI染色,流式细胞仪检测凋亡率,ARHI组细胞凋亡率(29.6±8.4)%,高于空载体组(23.4±6.8)%,但差异不具有显著性(P>0.05)；4)转染后72小时吖啶橙染色,可见ARHI组细胞内亮红色自噬溶酶体(9.3%)明显高于空载体组(0.4%),差异具有显著性(P<0.05)；通过透射电镜证实了吖啶橙染色结果：ARHI基因瞬时转染PANC-1细胞72小时透射电镜可见典型自噬体,空载体转染组未见自噬体。小结：1)ARHI基因瞬时转染组细胞凋亡率高于空载体转染组,但差异无显著型；2)ARHI再表达可诱导胰腺癌细胞系PANC-1发生自噬。二、抑癌基因ARHI诱导胰腺癌细胞系PANC-1自噬的相关机制初探目的：探讨ARHI再表达诱导PANC-1细胞系自噬的可能机制。方法：ARHI基因瞬时转染PANC-1细胞48小时、72小时后分别提取细胞总蛋白,western blot检测ARHI组及空载体组pERK、pAKT、AKT、DAPK 1、ATG4B表达水平的差异。瞬时转染后48小时、72小时分别提取细胞胞浆蛋白,、vestern blot检测ARHI组及空载体组胞浆p53蛋白水平的差异。瞬时转染后72小时进行细胞化学染色,观察胞核p53蛋白水平的差异。瞬时转染后48小时提取细胞总RNA,Real time PCR检测AKT下游信号分子TSC1、TSC2及自噬相关基因beclin1 mRNA水平表达改变。结果：1)瞬时转染48小时pERK与空载体组比较有轻度下调,但无显著性差异(P>0.05),72小时后ARHI组与空载体组pERK蛋白无明显差异；2)与空载体组相比,ARHI组pAKT蛋白表达明显减少(P<0.05),AKT蛋白无明显变化；3)瞬时转染48小时、72小时ARHI组与空载体组胞浆p53蛋白无明显差异,酶免疫细胞化学染色显示ARHI组与对照组胞核p53阳性率分别为18%和8%(P<0.05)；4)与空载体组相比,ARHI组DAPK1蛋白和ATG4B表达均增加(P<0.05)；5)与空载体相比,ARHI组TSC1、TSC2及beclin1 mRNA水平表达无明显变化。小结：ARHI瞬时转染诱导PANC-1细胞系自噬可能与下调PI3K/AKT通路及上调胞核p53、抑癌基因DAPK1、自噬相关基因ATG4B有关,与Ras/Raf/ERK通路无关,与TSC1、TSC2及beclin1转录水平表达无关。结论：1)ARHII基因再表达诱导胰腺癌细胞系(?)ANC-1自噬,凋亡及自噬性细胞死亡不显著。2)ARHI基因再表达诱导Ⅰ(?)ANC-1细胞系自噬可能与下调PI3K/AKT通路及上调胞核p53、抑癌基因DAPK1、自噬相关基因ATG4B有关。与Ras/Raf/ERK通路无关,与TSC1、TSC2及beclin1转录水平表达无关。