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目的:在分子、基因水平探讨健脾益气补髓方治疗实验性自身免疫性重症肌无力模型大鼠的免疫学机制。方法:1.采用注射免疫抗原的主动免疫方式建立实验性自身免疫性重症肌无力动物模型,通过观察临床症状、体重变化及检测模型大鼠外周血AchR-ab水平评价健脾益气补髓方对实验性自身免疫性重症肌无力动物模型的影响;2.采用ELISA的方法检测了大鼠外周血清IFN-γ、IL-4、IL-10水平;3.采用流式细胞荧光技术检测EAMG各组脾脏组织单个核细胞CD4~+T细胞数量以及CD4~+CD25~+Foxp3~+T细胞(Treg细胞)、T细胞亚群(Th1、Th2、Th17)的数量变化;4.采用RT-qPCR检测EAMG各组脾脏组织参与调节Th17/Treg细胞转化平衡相关细胞因子IL-17、TGF-β、IL-6、IFN-γ、IL-21的基因表达。结果:1.模型建立:首次免疫后45天进行第2次加强免疫,EAMG症状进一步加重,出现呼吸急促,颤抖进一步剧烈,无法抬颈,头部紧贴台面,EAMG评分高于CFA组,差异具有统计学意义(***P<0.001),此时毛色干枯,声音低微,精神萎靡下门牙生长过长,触及上颌,体重进一步减轻;首次免疫后25d,EAMG组与CFA组大鼠外周血清中Anti AchR-ab分泌水平无统计学差异(P=0.08>0.05)。首次免疫后45天进行第2次加强免疫,与CFA组相比,EAMG组大鼠外周血清中Anti AchR-ab分泌水平明显升高,二者具有显著性差异(***p<0.0001);2.EAMG体重及症状:EAMG组大鼠的体重随着实验进展,并未出现增长,且与CFA组大鼠体重始终具有显著性差异(***p<0.0001);与EAMG组大鼠比较,中药高、中、低剂量组大鼠,各组大鼠症状逐渐缓解,从给药20天开始,各剂量组大鼠体重增加较EAMG组具有统计学差异(**p<0.01),表明健脾益气补髓方改善EAMG体重及临床症状;3.EAMG外周血清中Anti AchR-ab抗体水平:EAMG组在整个灌胃期间直至结束,大鼠外周血清Anti AchR-ab水平始终高于CFA组。与EAMG相比较,中药各剂量组大鼠外周血清Anti AchR-ab水平明显降低,其中与低剂量组相比,中药高剂量组大鼠外周血清Anti AchR-ab水平降低明显,具有显著性差异(**p<0.01),中药高剂量组与强的松组相比,EAMG外周血清Anti AchR-ab水平降低程度相当,未见明显差异(p=0.22>0.05),表明强的松和中药各剂量组均可降低EAMG外周血清Anti AchR-ab水平,中药高剂量组较低剂量组,外周血清Anti AchR-ab水平下降更明显,且高剂量与强的松疗效相当;4.细胞因子水平:与CFA组相比较,EAMG组大鼠外周血清促炎细胞因子IFN-γ水平明显上升,抗炎细胞因子IL-4、IL-10明显下降,组间比较具有显著性差异(***p<0.001);经健脾益气补髓方各剂量干预后,促炎细胞因子IFN-γ水平明显下降,抗炎细胞因子IL-4、IL-10明显上升(**p<0.01);5.CD4~+T细胞分化亚群:与CFA组相比较,EAMG组大鼠脾脏组织单个核细胞CD4IL4~+T细胞(Th2细胞)、Treg细胞明显下降,组间比较具有显著性差异(***p<0.001),CD4~+T细胞、CD4~+IL-17~+T细胞(Th17细胞)和CD4~+IFN-γ~+T细胞(Th1细胞)数量明显上升,组间比较具有显著性差异(***p<0.001);与模型组比较,健脾益气补髓方低剂量组,Treg细胞明显上调,CD4~+T细胞、Th17细胞、Th1细胞数量明显减少,组间比较具有显著性差异(***p<0.001),但Th2细胞数量与模型组未见明显差异(p>0.05);健脾益气补髓方高、中剂量干预后,Th2细胞、Treg细胞明显上调,CD4~+T细胞、Th17细胞、Th1细胞数量明显减少,组间比较具有显著性差异(***p<0.001),且与强的松组疗效相当;6.各组大鼠脾脏细胞因子IL-17、TGF-β、IL-6、IFN-γ、IL-21的基因表达:与CFA组相比较,EAMG组IL-17、IFN-γ、IL-21、IL-6mRNA表达水平明显升高,有显著性差异(***p<0.001),TGF-βmRNA表达水平明显下降,有显著性差异(***p<0.001);与EAMG组比较,健脾益气补髓方高、中剂量干预后,IL-17、IFN-γ、IL-21、IL-6mRNA表达水平明显减少,组间比较具有显著性差异(**p<0.01),TGF-βmRNA表达水平明显增加,有显著性差异(**p<0.001);健脾益气补髓方低剂量组IL-17、IL-21mRNA表达水平明显减少,TGF-βmRNA表达水平增加,组间比较具有统计学差异差异(*p<0.05),但在IL-6与IFN-γmRNA表达水平与EAMG组,未见明显差异(p>0.05);结论:1.健脾益气补髓方降低实验性自身免疫性重症肌无力模型大鼠外周血anti AchR-ab水平,改善临床症状;2.健脾益气补髓方抑制了促炎细胞因子IL-17、IFN-γ的产生及基因表达,上调了抗炎细胞因子IL-4的表达,促进CD4~+T细胞向Th2细胞分化、抑制了CD4~+T细胞向Th17细胞和Th1细胞分化,改善了Th1/Th2/Th17细胞免疫失衡;3.健脾益气补髓方能够抑制促炎细胞因子IL-6及IL-21基因表达,上调了抗炎细胞因子IL-10的产生及TGF-β基因表达水平,从而抑制CD4~+T细胞向Th17细胞分化;促进Th17细胞向Treg细胞的分化,从而抑制EAMG的发展。