一、研究背景泌尿系结石是我国南方青壮年人群的常见病,其患病率高达4.87%-10%以上,而肾结石主要成分是一水草酸钙结晶,约占结石总数的80%。随着外科技术的发展,肾结石的治疗手段已经日益多样化,但其病因机制尚不清楚,目前仍然没有预防其发生和复发的有效方法,给社会经济造成巨大负担。目前的研究认为,肾结石的形成主要是成石因素与抑石因素两种对比力量失衡的结果,其中尿中成石物质浓度超饱和后析出结晶和尿结晶的黏附对肾小管上皮损伤是结石生成的两个必备条件,草酸钙结晶体对肾小管上皮损伤的具体病理生理过程为：草酸钙结晶→NADPH氧化酶的激活→ROS增加→亲环蛋白D的激活→线粒体通透性转换孔的开放→线粒体膜电位下降,线粒体的死亡→细胞色素C激活→Caspase-3的激活→细胞受损→细胞膜磷脂酰丝氨酸结构的改变→肾脏结晶的粘附,而后受损伤的细胞逐步变为碎片,成为核聚集的“大本营”,接着大分子物质迅速而牢固地黏附于其上,最终启动结石的级联反应,此时启动细胞多种抗氧化防御反应是至关重要的。Nuclear factor erythroid2-related factor2(NRF2)是具有基本亮氨酸拉链结构的核转录因子,它通过与称作抗氧化反应元件(Antioxidant response element, ARE)的一段增强子序列结合而诱导多种Ⅱ相解毒酶基因的协同表达。为了阻断脂质过氧化物的发生和发展,对抗其产生的损害作用,机体自身能诱导出一系列保护性蛋白,如超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)、血红素加氧酶-1(Heme oxygenase, HO-1)、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase, GSH)等,以减轻细胞所受的损害,而这协调反应是由NRF2-ARE通路来调控的。目前认为NRF2是调控细胞对抗氧化损伤的关键转录因子之一,NRF2缺失或激活障碍,会加重侵害物质对细胞的损伤,HO-1是Ⅱ相解毒酶最容易受诱导的抗氧化防御酶,能有效消除氧自由基,抑制细胞脂质过氧化和NADPH的氧化活性,上调抗凋亡蛋白的表达,减轻线粒体损伤,保护内皮细胞免受过氧化物质侵害引起的细胞凋亡。近年研究揭示NRF2/HO-1通路是细胞内重要的内源性抗氧化应激通路之一,上调此信号通路可诱导多种抗氧化酶及解毒酶,加速酶促反应,提高谷胱甘肽及超氧化物歧化酶等抗氧化物质的表达水平,维持细胞内的氧化还原状态,发挥细胞保护作用。复方金钱草为报春花科植物过路黄的干燥全草,作为排石之要药,已有200多年的应用历史,现代药理学研究证实,复方金钱草具有抑制草酸钙形成并增加其排泄,清除羟自由基氧,超氧自由基及抗脂质,对抗钙离子的失衡,改善组织的缺氧,抗炎症作用。其临床治疗尿结石的作用已得到不断验证,但其作用机理尚未完全清楚。鉴于此,本项研究拟分析复方金钱草对小鼠草酸钙结晶性肾损伤模型的作用及可能的作用机制。二、研究目的(一)、通过腹腔注射乙醛酸盐的方法诱导建立实验性小鼠肾草酸钙结晶模型,观察对肾脏的损害情况,并采用复方金钱草进行体内干预实验,初步探讨复方金钱草对小鼠草酸钙结晶肾损伤的保护作用。(二)、在小鼠肾草酸钙结晶模型建立后,观察其NRF2/HO-1蛋白的动态变化情况,探讨NRF2/HO-1通路是否参与肾草酸钙结晶肾损伤的发病机制。(三)、进一步探讨复方金钱草是否通过NRF2/HO-1通路起到了抗氧化应激的作用。三、研究内容第一部分复方金钱草对小鼠草酸钙结晶肾损伤的保护作用7-8周龄野生型雄性C57BL/6小鼠24只,将动物适应性喂养7天后,按随机数字表法随机分为对照组(A组)、单纯结晶组(B组)、复方金钱草干预组(C组),每组8只。B组：给予100mg/Kg乙醛酸盐；C组：给予100mg/Kg乙醛酸盐+20mlL/Kg复方金钱草浸膏；A组：给予100mg/Kg的生理盐水;乙醛酸盐与复方金钱草给药间隔10小时,给药方式：乙醛酸盐为腹腔注射,复方金钱草浸膏为灌胃,连续给药7天。第8天处死全部小鼠,内眦静脉取血,静置1小时后离心取血清,随后用生理盐水行心脏灌流,使肾脏干净,左侧肾脏纵行剖开一份即刻存放在液氮中,另一侧取皮髓质交界处组织送检。之后使用甲醛进行右侧肾脏内固定,取出肾脏并浸泡在4%的多聚甲醛液中用于病理分析。检测各组小鼠肾组织钙含量、GXH、丙二醛(Malondialdehyde, MDA)的表达水平及过氧化氢酶(Catalase, CAT)、CuZn-SOD活性变化,全自动生化分析仪测定血清尿素氮(Serum urea nitrogen, BUN)及肌酐(Serum creatinine, SCr)水平,采用Carraway双盲病理评分,评价各组小鼠肾脏损伤程度,冯库萨(VON KOSSA)染色,观察小鼠肾脏结晶程度,免疫组织化学法对各组小鼠肾组织钙离子转运通道蛋白V5(Transient receptor potential cation channel V5, TRPV5)、肾脏组织骨桥蛋白(Osteopontin, OPN)、跨膜糖蛋白(Hyaluronan, CD44)进行定位检测：免疫荧光法对钙结合蛋白(Calbindin-D28k)进行定位分析,Western blot法检测各组肾组织中TRPV5、Calbindin-D28k、OPN、CD44、Caspase-3和Bcl-2含量,原位末端转移酶标记技术检测各组小鼠肾脏小管上皮细胞凋亡情况,增殖细胞核抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen, PCNA)免疫组化法检测各组小鼠肾脏小管上皮细胞增殖情况。第二部分NRF2/HO-1通路参与草酸钙结晶肾损伤的过程48只雄性C57BL/6小鼠,按取材时相点随机分为6组分别为：0h组、24h组,48h组,72h组、96h组、120h组、每组8只。0h组正常饲养,其余各组每间隔24h分别给予100mg/Kg乙醛酸盐,给药方式均为腹腔注射,各组小鼠于给药后相对应的时刻即0h、24h、48h、72h、96h、120h等5个时相点,处死全部小鼠,随后采用第一部分叙述的方法处理小鼠标本及组织并测定各组小鼠肾组HO-1活性变化,冯库萨染色,观察小鼠肾脏结晶程度,Real time PCR法分析HO-1mRNA和NRF2mRNA表达水平;Westernblot法检测各组肾组织中HO-1、NRF2蛋白含量。第三部分NRF2/HO-1通路介导复方金钱草对草酸钙结晶肾损伤的保护作用56只雄性C57BL/6小鼠,随机分为7组分别为：对照组(A组)、单纯Hemin组(B组)、结晶+Hemin组(C组)、单纯复方金钱草组(D组)、单纯结晶组(E组)、结晶+复方金钱草组(F组)、结晶十复方金钱草+Snpp组(G组),每组8只,适应性喂养7天,对照组正常饲养：给予100mg/Kg的生理盐水；单纯结晶组：给予100mg/Kg乙醛酸盐；单纯复方金钱草组：给予20ml/Kg复方金钱草浸膏；单纯Hemin组(HO-1的诱导剂)：给予Hemin30μmol/kg;结晶+复方金钱草组：先给予20ml/Kg复方金钱草浸膏,后给予100mg/Kg乙醛酸盐；结晶+Hemin组：先给予Hemin30μmol/kg,后给予100mg/Kg乙醛酸盐；结晶+复方金钱草+Snpp组(HO-1的抑制剂)：先给予20mml/Kg复方金钱草浸膏,后给予100mg/Kg乙醛酸盐,而后给予25mg/kgSnpp。乙醛酸盐、Hemin、Snpp给药方式为腹腔注射,复方金钱草为灌胃,24h后处死全部小鼠,随后采用第一部分叙述的方法处理小鼠标本及组织。测定各组小鼠肾组织HO-1活性变化,冕疫组织化学法对小鼠肾脏HO-1进行定位检测,Real time PCR法分析HO-1mRNA、NRF2mRNA、 KEAP-1mRNA表达水平：Western blot法检测各组肾组织中HO-1、NRF2和KEAP-1蛋白含量。四、研究结果第一部分血生化结果显示：单纯结晶组BUN、SCr值比对照组有明显升高,而复方金钱草治疗组BUN、SCr值明显低于单纯结晶组相比,本实验亦发现,单纯结晶组MDA、肾钙含量比正常对照组显著升高,复方金钱草治疗组的SOD、CAT、GSH较单纯结晶组小鼠有明显的提高,而MDA、肾钙含量有显著下降,并且减少了钙盐的沉积。免疫组化及免疫印迹蛋白结果显示：OPN及CD44在所有3组中均有表达,与A组相比,B组及C组肾组织中的OPN及CD44表达明显增多,但C组肾组织中OPN及CD44表达强度弱于B组。免疫印迹蛋白及免疫组化结果显示：与对照组相比,单纯结晶组小鼠表达的TRPV5和Calbindin-D28k明显减弱,结晶+复方金钱草组发现其TRPV5和Calbindin-D28k表达量虽弱于对照组,但强于单纯结晶组。原位末端转移酶标记技术检测及PCNA免疫组化法显示,单纯结晶组小鼠出现较多肾脏上皮细胞凋亡,而结晶+复方金钱草组较单纯结晶组明显减少,与对照组相比,单纯结晶组的肾组织细胞增殖则明显减弱,结晶+复方金钱草组发现其肾组织细胞增殖虽弱于对照组,但强于单纯结晶组。免疫印迹蛋白技术检测结果显示：与对照组比较,单纯结晶组小鼠肾脏组织内凋亡关键蛋白活化型Caspase-3表达显著增加,抗凋亡关键蛋白Bcl-2表达亦显著增加；而结晶+复方金钱草小鼠肾组织活化型Caspase-3表达明显下降,而Bcl-2表达较单纯结晶组显著增加。第二部分本实验研究发现,在给予小鼠乙醛酸盐诱导后,其肾脏钙盐的沉积在24h、48h时相点我们并没有观察到结晶体沉积,而在72h时相点小鼠肾小管腔中出现少量结晶体,96h时相点小鼠肾小管腔中出现较多结晶体,120h时相点可见皮髓交界处大量的黑色钙盐结晶体沉积小管腔内,小鼠肾组织HO-1活性测定结果显示,在给予乙醛酸盐诱导后24h后其活性达到高峰,而后其活性随着时间的延长,逐渐的下降,Westernblot及其PCR方法结果显示,在24h时相点HO-1、NRF2蛋白表达量及其mRNA达到高峰,而后随着时间的延长,含量逐渐的下降。第三部分免疫组织化学结果显示：各组小鼠的肾小管上皮细胞的细胞膜均有棕黄色的阳性染色颗粒,但B、C、D、E、F、G组的阳性染色强度显著高于A组；B、C组的阳性染色强度高于D、E、F、G组,但D、E、F、G组未见有差异。肾组织HO-1活性结果显示：与A组相比,B、C、D、E、F组小鼠肾组织HO-1活性显著增加;而G组显著下降；与G组相比,B、C、D、E、F组小鼠肾组织HO-1活性显著增加,B、C两组肾组织HO-1活性显著强于D、E、F组,但D、E、F组之间肾组织HO-1活性没有显著性差异；B、C组之间也没有显著性差异。RT-PCR及免疫印迹蛋白结果显示,B、C、D、E、F、G组小鼠肾组织HO-1、NRF2、KEAP-1蛋白及mRNA表达量显著强于A组：B、C两组HO-1、NRF2、KEAP-1蛋白及mRNA表达量显著强于D、E、F、G组,但D、E、F、G组之间HO-1、NRF2、 KEAP-1蛋白及mRNA表达量无显著性差异,B、C组之间也没有显著性差异。五、研究结论(一)复方金钱草可能通过抑制过氧化应激途径减轻小鼠草酸钙结晶性肾损伤,抑制促凋亡关键蛋白Caspase-3活化、诱导抗凋亡蛋白Bcl-2表达,减少细胞凋亡,促进细胞增殖,起到了保护肾小管上皮细胞的作用,可能通过上调肾脏TRPV5及Calbindin-D28k的表达量降低尿液中钙离子的含量,从而减少草酸钙结晶的形成。(二)NRF2/HO-1通路可能参与草酸钙结晶肾损伤的过程,而复方金钱草可能通过激活KEAP-1/NRF2/ARE信号通路,最终诱导多种抗氧化酶及Ⅱ相解毒酶表达,从而起到了保护肾脏组织细胞的作用。