研究目的苯是一种透明油状液体,是具有芳香气味的无色或浅黄色的液体。苯作为一种重要的生产原料和有机溶剂在多种工艺中被使用,是职业场所中常见的一种毒物和污染物。1982年国际癌症研究机构(IARC)将苯规定为公认的环境致癌物质。在我国,慢性职业中毒中苯中毒连续多年居于首位。血液系统是慢性苯中毒损害的一个主要靶点。在中毒早期主要引起外周血白细胞减少为,再生障碍性贫血,粒细胞白血病是苯中毒严重时导致的结果。针对慢性苯中毒的治疗目前尚无特定的特效药,主要采用对症、纠正贫血、升高白细胞、支持疗法和抗肿瘤化疗药物进行治疗,但是长期使用可引一系列副作用,如发热、乏力、骨痛、甚至刺激恶性细胞生长等。因此,现在极为重要的是在生活中寻找一种干预药物通过饮食来预防慢性苯中毒。大蒜素在常温下快速的被代谢分解为具有多种生物学功效的有机硫化物(OSCs),如二烯丙基三硫(DATS)、二烯丙基二硫(DADS)、二烯丙基一硫(DAS)等。DAS的拮抗效果在慢性苯中毒诱导的白细胞减少方面是否也发挥作用尚未见报道。因此,在本次实验中我们选择的干预药物是DAS,经过经口染苯建立外周血白细胞减少症模型,分两部分试验来进行,试图证实DAS是否对苯诱导的小鼠外周血白细胞减少症有拮抗作用?拮抗机制是什么?第一部分,选择ICR小鼠90只,随机分成空白对照组、DAS对照组、苯模型组、DAS低、中、高剂量干预组,每组15只。苯模型组和DAS各干预组动物均经口给予苯(1.3g/kg.bw),使用玉米油溶解苯,随后以等体积的玉米油给与另外两组实验动物。2 h前,分别给予苯+DAS低、中、高剂量干预组和DAS对照组40、80、160、160mg/kg的DAS,其余两组给以等体积的玉米油,1次/d,持续4周。分别于第14、29天经眼内眦取血于抗凝管中以检测血常规;于第30天,处死动物,迅速取脾脏和胸腺称重并计算脏器系数;取适当部位的脾脏、胸腺经固定后制备石蜡切片做病理学检查,剩余部分于-80℃冷冻保存。结果发现:1.血常规改变与空白对照组比较,苯模型组小鼠染毒第14d外周血白细胞计数下降68.99%,差别有统计学意义(P<0.01),其中淋巴细胞、单核细胞分别降低了 71.72%,53.19%,差异均有统计学意义(P<0.01);与染毒第14天比较,苯模型组小鼠染毒第29天淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞进一步分别下降为83.00%,81.03%,89.37%,差异有统计学意义(P<0.01或0.05);红细胞、血红蛋白分别降低20.84%,19.25%,差异有统计学意义(P<0.01或0.05)。与苯模型组相比较,DAS高剂量干预组干预第14天白细胞计数明显增加270.30%,差异有统计学意义(P<0.01),其中,单核细胞、淋巴细胞分别增加136.36%、260.00%,差异有统计学意义(P<0.01或0.05);与干预第14天比较,第29天干预效果明显。DAS低、中、高剂量各干预组白细胞分别增长95.76%,167.80%,453.39%,差异均有统计学意义(P<0.01);淋巴细胞分别增加114.67%,157.33%,553.33%,差异均有统计学意义(P<0.01);DAS中剂量组单核细胞增加154.55%(P<0.01),中性粒细胞增加281.82%(P<0.01);DAS高剂量组单核细胞增加472.73%(P<0.05),中性粒细胞增加713.64%(P<0.01);经DAS干预后,小鼠红细胞、血小板、血红蛋白均明显增高,具有统计学差异(P<0.01或 0.05)。2.病理改变肉眼观察可见空白对照组脾脏颜色暗红,表面光滑,被膜完整,质脆而软,形状呈长椭圆状。苯模型组脾脏颜色变淡,表面粗糙,形状大小较空白对照组变小。DAS40m/kg、80m/kg、160m/kg各剂量干预组无论脾脏颜色还是大小均有恢复趋势。空白对照组具有被膜完整的胸腺,质软,乳白色,短小肥厚。苯中毒模型组胸腺颜色变浅,小而扁平。与苯模型组比较,DAS 40m/kg、80m/kg、160m/kg剂量干预组胸腺病理组织颜色和大小均有不同程度的改善,趋于空白对照组。肉眼观察脾脏病理在DAS对照组中未见明显可见病变。镜下观察正常脾脏被膜呈粉红色,红髓呈深红色,白髓致密呈紫蓝色,为脾结节。红髓和白髓界限清晰。相较于空白对照组,苯中毒模型组脾脏病理色淡,红髓数目多且呈淡粉色,松散分布的白髓及其白髓间分布数量较少的淋巴细胞,红白髓界限不明显。与苯模型组相比较,DAS40m/kg、80m/kg、160m/kg各剂量干预组白髓、红髓的颜色、界限、数目均有不同程度的好转。与空白组对照比较,DAS对照组脾脏病理接近空白对照组,肉眼观察无明显可见病变。与空白对照组比较,苯模型组脾脏白髓面积比降低明显(P<0.01);与苯模型组比较,DAS40m/kg、80m/kg、160m/kg各剂量组脾脏白髓面积比显著升高(P<0.01或0.05)。正常胸腺轮廓表面被膜呈粉红色,皮质胸腺细胞致密呈深紫蓝色,髓质颜色较浅,皮质和髓质界限清晰。相较于空白对照组,苯模型组中胸腺的皮质变薄,皮质间含有少量的胸腺细胞,皮质与髓质界线不清晰。与苯模型组相比较,DAS低、中、高剂量组皮质厚度、胸腺细胞的数目均有不同程度的恢复。相较于空白对照组,苯模型组皮质面积降低(P<0.01);与苯模型组相比较,DAS40m/kg、80m/kg、160rm/kg剂量组胸腺皮质面积好转(P<0.01或0.05)。DAS对照组胸腺皮质面积比呈降低趋势(P<0.01)。3.脏器系数改变脾脏重量、脾脏系数、胸腺重量、胸腺系数均值在各组小鼠中存在统计学差异;和空白对照组比较,苯中毒模型组脾脏重量、脾脏系数、胸腺重量、胸腺系数均降低(P<0.01)。与苯模型组比较,DAS80mg/kg.bw、160mg/kg.bw干预组脾脏重重、脾脏系数明显升高(P<0.01或0.05),DAS160mg/kg.bw干预组胸腺重量、胸腺系数显著升高(P<0.01)。第二部分,选用大鼠建立白细胞减少模型,对DAS升高白细胞的作用和机制做进一步探讨。按照第一阶段动物分组及处理方法进行第二阶段的实验,4周连续灌胃,于4周末麻醉大鼠(戊巴比妥50mg/kg.bw),腹主动脉法取血进行血常规检测,摘取脾脏和胸腺进行脏器系数计算、,摘取两侧股骨冲取骨髓细胞进行骨髓白细胞计数、骨髓嗜多染红细胞微核、γH2AX表达量、氧化抗氧化指标的检测和氧化抗氧化相关蛋白表达的检测。结果显示:1.血常规改变相较于空白对照组,苯中毒模型组外周血白细胞计数降低了59.76%(P<0.01),其中单核细胞降低了 69.90%(P<0.01)、中性粒细胞降低了73.97%(P<0.01),淋巴细胞比例呈现增加趋势32.28%(P<0.01),血红蛋白、红细胞、血小板分别降低了 57.74%、5.02%、2.52%、(P>0.05);与苯模型组比较,DAS中、高剂量干预组白细胞计数增加了 164.86%、132.97%(P<0.01),其中DAS低、中、高剂量干预组单核细胞、中性粒细胞比例增加(P<0.01),淋巴细胞比例降低(P<0.01)。2.骨髓中白细胞计数骨髓白细胞计数均值在各组间具有统计学差异。相较与空白对照组,经苯染毒的大鼠骨髓白细胞计数降低了 33.11%(P<0.01),其中单核细胞、中性粒细胞比例分别降低了 39.61%、28.64%,淋巴细胞比例增加了 15.79%;与苯模型组比较,DAS低、中、高剂量干预组白细胞计数显著增加了 137.92%、273.56%、378.66%(P<0.01),其中中性粒细胞比例在DAS低、中、高剂量干预组中均增加(P<0.01)。3.骨髓嗜多染红细胞微核率检测大鼠骨髓嗜多染红细胞微核数(MPCE)、微核率(‰)在各组间存在统计学差异(P<0.05)。苯模型组中大鼠MPCE数、微核率(‰)升高(P<0.05)相较于空白对照组;而与苯模型组比较,DAS各剂量干预组MPCE数、微核率(‰)降低(P<0.05)。DAS对照组(160mg/kg)MPCE数、微核率(‰)与空白对照组比较无统计学差异。4.BMCs及PBLs中γH2AX表达量的影响各组间BMCs中γH2AX的平均荧光强度和相对荧光强度存在统计学差异(P<0.05)。和空白对照组相比,苯模型组γH2AX的平均荧光强度和相对荧光强度升高(P<0.05);与苯模型组比较,DAS80、160mg/kg剂量干预组γH2AX的平均荧光强度和相对荧光强度降低(P<0.05)。各组间大鼠PBLs中γH2AX表达的平均荧光强度和相对荧光强度的均值具有统计学差异(P<0.05)。与空白对照组比较,苯模型组γH2AX的平均荧光强度和相对荧光强度升高的均值(P<0.05);与苯模型组相比,DAS低、中、高剂量干预组γH2AX的平均荧光强度和相对荧光强度的均值呈降低趋势(P<0.05)。5.血清中MDA浓度、T-SOD活性、GSH含量、GSH/GSSG比值、T-AOC水平的改变MDA浓度均值在各组血清之间有统计学差异。与空白对照组,MDA浓度在苯模型组中呈增加趋势(P<0.01);与苯模型组对比,DAS高剂量干预组MDA浓度减少(P<0.01)。各组T-SOD活性均值存在统计学差异。与苯模型组比较,DAS80mg/kg、160 mg/kg剂量干预组T-SOD活性升高(P<0.01或0.05);而苯模型组T-SOD活性相较于空白对照组降低(P<0.01)。与苯模型组相比,DAS高(160mg/kg)剂量干预组GSH、GSH/GSSG升高(P<0.01或0.05);而相较于空白对照组,苯模型组GSH、GSH/GSSG降低(P<0.01)。与苯模型组比较,T-AOC在DAS40、80、160mg/kg剂量干预组升高(P<0.01或0.05)。而在苯模型组中的T-AOC能力相较于空白对照组降低(P<0.05)。6.脾脏匀浆中MDA浓度、T-SOD活性、GSH含量、GSH/GSSG 比值、T-AOC水平的变化脾脏中MDA浓度均值在各组间存在统计学差异。与苯模型组比较,DAS40、80、160 mg/kg剂量干预组MDA浓度降低(P<0.01);与空白对照组对比,苯模型组MDA浓度增长(P<0.05)。T-SOD活性均值在各组间存在统计学差异。与空白对照组对比,苯模型组T-SOD活性减少;与苯模型组比较,DAS160mg/kg干预组T-SOD活性升高(P<0.05)。与空白对照组比较,苯模型组GSH、GSH/GSSG 比值降低(P<0.01或0.05);与苯模型组比较,DAS40、80、160mg/kg各剂量干预组GSH、GSH/GSSG比值升高(P<0.01 或 0.05)。与空白对照组比较,苯模型组T-AOC降低(P<0.05);与苯模型组比较,DAS40、80、160 mg/kg剂量干预组T-AOC升高(P<0.05)。7.BMCs 中 MDA 浓度、T-SOD 活性、GSH 含量、GSH/GSSG 比值、T-AOC水平的改变骨髓细胞中MDA浓度均值在各组之间存在统计学差异。与空白对照组对比,苯模型组MDA浓度增长(P<0.05);与苯模型组相比,MDA浓度在DAS40、80、160 mg/kg干预组呈降低趋势(P<0.01)。与空白对照组对比,苯模型组T-SOD活性下降;而与苯模型组相比,DAS40mg/kg剂量干预组T-SOD活性升高(P<0.05)。与空白对照组对比,模型组GSH、GSH/GSSG 比值降低;与苯模型组比较,DAS160mg/kg 剂量干预组 GSH、GSH/GSSG 比值升高(P<0.05)。与空白对照对比,苯模型组T-AOC降低;与苯模型组比较,DAS40、80、160 mg/kgge各剂量干预组T-AOC升高。8.PBMCs 中 MDA 浓度、T-SOD 活性、GSH 含量、GSH/GSSG 比值、T-AOC水平的改变苯模型组MDA浓度相较于空白对照组MDA浓度增加(P<0.01);而与苯模型组相比,DAS40、80、160 mg/kg剂量干预组MDA浓度降低(P<0.01)。与空白对照组相比,苯模型组T-SOD活性降低;与苯模型组比较,T-SOD在DAS40、80、160 mg/kg剂量干预组活性呈升高趋势。苯模型组GSH、GSH/GSSG比值降低相较于空白对照组;与苯模型组比较,DAS中、高剂量干预组GSH、GSH/GSSG比值升高(P<0.01或0.05)。与空白对照比较,苯模型组T-AOC降低(P<0.05);与苯模型组比较,DAS40、80、160 mg/kg剂量干预组T-AOC升高。9.氧化应激相关蛋白在骨髓细胞中的表达情况与空白对照组相比,苯模型组中Keap1和Nrf2的蛋白表达分别降低50.21%和51.09%。其下游抗氧化蛋白γ-GCSC,HO-1,SOD-1等表达量分别降低38.12%,50.09%,65.12%。与苯模型组相比较,相关蛋白的表达量在DAS各剂量干预组均有改善。结论1.连续四周灌胃苯导致苯模型组外周血白细胞减少,可判定外周血白细胞减少动物模型构建成功。2.DAS各剂量组可升高外周血白细胞和骨髓白细胞数量,证明其具有拮抗血液毒性和骨髓抑制的作用。3.DAS拮抗苯的骨髓抑制,减少DNA损伤,可能与激活Keap1/Nrf2通路,上调下游蛋白相关蛋白NQO1、γ-GCSc、SOD-1表达,减少脂质过氧化,改善了氧化应激有关。