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失血性休克是临床常见的危急重症,血管低反应性是失血性休克难治的重要因素也是患者死亡的主要原因,且休克肠淋巴液(post-hemorrhagic shock mesenteric lymph,PHSML)回流是导致休克后血管低反应性的重要机制之一。星状神经节阻滞(stellate ganglion block,SGB)可以通过降低交感神经兴奋性,调节局部血液循环,但SGB能否改善休克后血管低反应性,尚未见报道。血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)作为血管壁的基质细胞参与了血管的生理和病理变化。在某些血管疾病的发病过程中,VSMCs细胞自噬被激活,过度自噬引起了VSMCs的坏死和凋亡。但是,VSMCs过度自噬是否与失血性休克后血管低反应性的发生机制有关?SGB能否通过抑制VSMCs自噬来改善失血性休克后的血管低反应性?PHSML回流介导血管低反应性作用是否与VSMCs过度自噬有关?以及SGB的作用与PHSML回流、血管低反应性、VSMCs自噬之间的关系如何?均有待进一步研究证实。为此,本研究应用失血性休克大鼠清醒模型,观察SGB和自噬抑制剂对失血性休克后大鼠肠系膜微动脉血管反应性的影响,进一步观察自噬激动剂、静脉输入PHSML对SGB的作用,明确细胞自噬在SGB改善失血性休克后血管反应性中的肠淋巴机制。随后,在VSMCs细胞水平上,观察PHSML、SGB处理失血性休克大鼠的肠淋巴液(PHSML obtained from the rats underwent hemorrhagic shock plus SGB treatment,PHSML-SGB)以及自噬抑制剂等因素对VSMCs活力、细胞收缩能力以及细胞自噬相关蛋白表达的作用,进而阐明SGB干预失血性休克后PHSML介导血管低反应性的细胞自噬机制,为防治失血性休克后血管低反应性提供新的实验资料,同时扩展SGB的临床应用。首先,应用失血性休克大鼠模型,给予SGB预处理,常规方法分别留取PHSML、PHSML-SGB。然后,将42只雄性健康成年大鼠随机均分为7组,假手术组(Sham)、施予SGB术的假手术组(Sham+SGB)、休克组(Shock)、施予SGB术的休克组(Shock+SGB)、自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)治疗的休克组(Shock+3-MA)、自噬激动剂雷帕霉素(Rapamycin,Rapa)干预的Shock+SGB组(Shock+SGB+Rapa)、静脉输入PHSML的Shock+SGB组(Shock+SGB+PHSML)。各组大鼠在液体复苏结束后3 h或相应时间点,留取固定位置的肠袢,体式显微镜下分离肠系膜二级微动脉,制备微动脉血管环,采用四通道离体血管张力测定仪检测微动脉张力对梯度去甲肾上腺素(Norepinephrine,NE)的收缩反应性。结果显示,Sham组与Sham+SGB组大鼠肠系膜微动脉对NE各浓度的收缩反应性均无明显差异(P>0.05);Shock组大鼠肠系膜微动脉对NE的反应性显著低于Sham组(P<0.05);Shock+SGB组大鼠肠系膜微动脉对NE的反应性显著高于Shock组(P<0.05),且与Sham组大鼠肠系膜微动脉对各浓度NE的收缩反应性基本相同(P>0.05);自噬抑制剂3-MA显著提高了失血性休克大鼠肠系膜微动脉对梯度NE的反应性(P<0.05);自噬激动剂Rapa降低了Shock+SGB组大鼠微动脉对梯度NE的收缩反应性(P<0.05);静脉输入PHSML降低了Shock+SGB组大鼠微动脉对梯度NE收缩反应性(P<0.05)。随后,取正常传代培养的大鼠VSMCs,分为对照组(Control)、PHSML组、PHSML-SGB组、PHSML+3-MA组、PHSML-SGB联合PI3K抑制剂LY294002处理组(PHSML-SGB+LY294002)、PHSML-SGB联合Akt抑制剂MK2206组(PHSML-SGB+MK2206)、PHSML-SGB+Rapa组。采用CCK-8法检测各组细胞活力,应用Transwells双室培养、通过VSMCs对荧光标记白蛋白的累积透过率观察各组细胞对NE的收缩反应性。细胞活力结果显示,PHSML明显抑制了VSMCs细胞活力(P<0.05),3-MA可抵消PHSML对VSMCs细胞活力的抑制作用(P<0.05),PHSML-SGB组细胞活力明显高于PHSML组(P<0.05);LY294002、MK2206以及Rapa均可抑制PHSML-SGB组的VSMC细胞活力(P<0.05)。VSMCs收缩反应性结果显示,PHSML处理后VSMCs对荧光标记白蛋白的累积透过率显著低于Control组(P<0.05),PHSML-SGB、PHSML+3-MA组VSMCs对荧光标记白蛋白的累积透过率显著高于PHSML组(P<0.05)。但是,PHSML-SGB+LY294002组VSMCs对荧光标记白蛋白的累积透过率显著高于PHSML-SGB组(P<0.05),PHSML-SGB+MK2206和PHSML-SGB+Rapa两组VSMCs对荧光标记白蛋白的累积透过率与PHSML-SGB组无统计学差异(P>0.05)。最后,取正常VSMCs,根据处理因素不同,分为Control、PHSML、PHSML-SGB、PHSML+3-MA四组,免疫荧光法检测微管相关蛋白轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3-II)表达;蛋白印迹法检测细胞自噬标志蛋白LC3-II、自噬效应蛋白Beclin1以及选择性自噬接头蛋白p62(sequestosome 1,p62)的表达。结果显示,与Control组相比,PHSML组LC3-II、Beclin1表达明显增加,p62表达明显降低(P<0.05);相比之下,PHSML-SGB和PHSML+3-MA组LC3-II、Beclin1表达显著低于PHSML组,p62表达显著增高(P<0.05)。综上结果表明,SGB改善了失血性休克后的血管反应性,VSMCs过度自噬参与了失血性休克后血管低反应性的发生过程,PHSML介导失血性休克血管低反应性与VSMC过度自噬有关,SGB通过降低VSMC过度自噬抑制了PHSML介导的血管低反应性。