背景与目的:肺癌是全世界发病率和死亡率最高的恶性肿瘤,当前生存率仍较低,因次当务之急是探索有效的治疗措施。目前一些研究报道,肺部转染会加速肺癌的进展。LPS (Lipopolysaccharide,脂多糖)是革兰氏阴性杆菌外膜的主要成分之一,能够直接促进肿瘤进展[5-7]。TLR4(Toll-likereceptor4,Tol1样受体4)能够识别革兰氏阴性杆菌的LPS,TLR4表达增强预示肺癌病人病情进展。这些发现表明通过LPS活化TLR4对肺癌进展至关重要。然而,肺癌进展是否与LPS直接相关及其相关机制尚不明确。MiRs (MicroRNAs,寡核糖核酸)是非编码小RNA分子,是重要的mRNA和蛋白表达的调节者,在癌症进展中充当了重要而又复杂的角色。MiRs与多种恶性肿瘤的发生进展密切相关。MiR-21是MiRs一种,是在实体瘤中最常见表达的寡核糖核酸,其在恶性肿瘤组织中表达量与正常组织相比高5～100倍。MiR-21的表达与肺癌细胞的增殖、侵袭、转移密切相关,对肺癌诊断及预后具有重要意义。最近研究表明MiR-21参与LPS诱导的免疫应答。这些发现表明MiR-21可能参与LPS诱导的肿瘤细胞生长。在这些研究中,我们描述了 LPS在肺癌肿瘤细胞生长过程中的作用,评估了MiR-21在其过程中的意义。证实在肺癌肿瘤细胞生长过程中MiR-21是必须的。肺癌肿瘤细胞中LPS活化TLR4后,会引起ROS产生增多,ROS反过来又会引起miR-21表达上调。这些研究可进一步理解肺癌的发病机制,并对肺癌的治疗提出新的治疗措施。材料和方法:道德规范声明所有病人通过邮件形式参与研究。临床样本研究遵从1964年《赫尔辛基宣言》及其修订版。动物实验按照医学动物实验手册执行。人和动物实验也同时也遵从同济机构(Institutiongal)伦理委员会。病人全部50名肺癌病人转染革兰氏阴性杆菌入组研究。肺癌均为病理诊断。样本中有自身免疫疾病或经过免疫治疗的排除在外。鼠从上海动物实验中心购买6-8周雌性BALB/c裸鼠,所有小鼠均在无病原体条件下饲养。细胞培养和试剂人肺癌细胞取自组织标本。将组织标本放置于50mL的离心管内,离心管内加入5～10 mLⅠ型胶原酶溶液(Invitrogen)(在LHC培养基中溶解胶原酶Ⅰ,最终浓度为1 mg/mL)。在37℃水浴箱中温浴、振荡1小时。将含青/链霉素、10%胎牛血清(fet bovine serum,FBS)的LHC培养基混匀细胞接种至24孔培养板中,放入35%C0、2℃、饱和湿度培养箱中,每2～3天观察细胞生长状态,并半量换液。LPS 购自 Sigma, psiRNA 载体及对比剂购自 Origene,Mir-21 (MI0000077)表达载体及对比剂购自Origene,人miR-21shRNA(shADV-215486)及对比剂购自Vector Biolabs,Tempol购自Santa Cruz。所有试剂均规范使用。体外肿瘤生长利用MTT比色法分析原代人肺癌细胞扩增表达观察体外肿瘤生长。将96孔培养板每孔中接种4X103个肺癌细胞,加入或不加入LPS(0. ug/ml、1ug/ml、10ug/ml),培养3天,每天观察肿瘤生长。用MTT比色法分析细胞扩增。体内肿瘤生长裸鼠内原代肺癌细胞生长监测如前所述。将4X 106个原代肺癌细胞悬浮于200u1PBS中,将其注射于裸鼠的皮下。相同剂量的PBS注入对照组小鼠。在皮下注射前,用LPS (10ug/ml)处理原代肺癌细胞24小时,或用PBS作为参照。用数显卡尺测量移植后3、6、9天后的肿瘤体积。每个肿瘤均被不同人员测量两次。R-T PCR检测利用 Qiagen RNeasy mini kit 提取总的 RNA,利用 Maxima First Strand cDNA Synthesisb Kits (Thermo Scientific 公司)转录合成 cDNA,引物购自 Applied Biosystems 公司,利用 Maxima SYBR Green qPCR Master MIXES (美国 Thermo)的试剂定量PCR分析进行重复检测mRNA的表达,GAPDH作为内对照。TaqMan miRNA assays (Applied Biosystems 公司)监测 miRNA 表达,U6 RNA 作为内参照。流式细胞仪检测流量分析,PE共轭抗体人抗TLR4抗体0. 5 X 106个细胞染色(12-9917-42,eBioscience公司),或同型对照(12-4724-81,eBioscience公司),流式细胞仪分析。用 CellROX Deep Red Reagent (Life Technologies 公司)检测 ROS水平。Flowjo软件分析统计数据。结果:1.LPS促进肺癌进展为研究LPS在肺癌肿瘤细胞生长过程中的作用,用不同剂量的LPS (0.1 ug/ml、1ug/ml、10ug/ml)刺激肺癌细胞,观察细胞的生长。结果显示肺癌细胞的生长与LPS存在剂量依赖性。在肺癌细胞中能快速发现TLR4。TLR4被LPS刺激后,表达明显上调,与剂量呈正相关。为研究TLR4、LPS在肺癌细胞生长中的作用,将肺癌原代细胞转染上TLR4 shRNA,然后给予LPS刺激调控。发现转染上TLR4 shRNA的肺癌细胞,TLR4在mRNA和蛋白水平上的表达均降低,并阻碍脂多糖诱导肺癌原代细胞的生长。这些数据表明TLR4是LPS诱导的肿瘤细胞生长的关键受体。为确定在活体上LPS促肺癌细胞生长过程中的作用,将肺癌细胞注入小鼠体内。发现有LPS刺激的肺癌细胞生长速度明显高于无LPS刺激的肺癌细胞。阻断TLR4后,就减缓了肺癌细胞生长。实质上,这些结果表明通过LPS激发TLR4后可促进肺癌细胞生长。2. LPS促进肺癌细胞生长中需要MiR-21为评估MiR-21在LPS促进肺癌细胞生长中的作用,观察MiR-21在肺癌细胞中的表达。发现MiR-21与LPS存在剂量依赖性。LPS促进肺癌细胞生长过程中,阻断TLR4后,MiR-21的表达同样也出现抑制。当肺癌细胞转染miR-21 shRNA后,LPS激活肺癌细胞,发现转染miR-21 shRNA的肺癌细胞表达降低,并阻断了 LPS诱导的肿瘤生长。为研究miR-21在LPS促进肺癌细胞体内生长过程中的潜在作用,将转染m iR-21 shRNA和预处理LPS的肺癌细胞种植于裸鼠体内,结果显示下调miR-21表达会减弱LPS增强肺癌细胞增长。这些结果表明LPS促进肺癌细胞增长是需要miR-21强化的。3. MiR-21促进肺癌细胞生长假定MiR-21在LPS诱导肿瘤生长中的重要作用,发现了 miR-21自身促肺癌细胞生长的功能。转染miR-21的肺癌细胞导致miR-21表达上调和肿瘤生长。转染miR-21 shRNA缓解肺癌细胞生长。为证实在体内的研究结果,将转染miR-21及miR-21 shRNA的肺癌细胞分别植入裸鼠内,发现在体内增加miR-21表达增强肿瘤生长,降低miR-21表达会减弱肿瘤生长。这些发现认为miR-21是肺癌肿瘤生长的必须致癌miRNA。众所周知m iR-21作用于磷酸酶基因(PTEN)和程序性细胞死亡因子(PDCD4),但是否在肺癌细胞中miR-21亦作用于PTEN和(PDCD4)。转染miR-21的表达降低了 PTEN和PDCD4的表达。反之亦然,转染miR-21 shRNA使PTEN和PDCD4的表达上调。更重要的是,PTEN和PDCD4的过度表达会阻断肺癌细胞生长中miR-21的致癌作用。这些数据表明在肺癌中PTEN和PDCD4是miR-21主要作用目标。4. LPS引起miR-21表达,引起细胞内ROS产生增加活性氧(ROS)参与TLR4激发的免疫应答和肺癌进展。发现肺癌细胞内ROS水平与LPS浓度呈正相关,LPS浓度愈高,ROS水平亦愈高。结果表明在肺癌细胞中LPS促进ROS的产生。阻断TLR4后则阻断LPS诱导ROS的产生。为研究LPS诱导肺癌生长中ROS的作用,将LPS处理的肺癌细胞,再用Tempol (4-羟基-2,2, 6,6-四甲基哌啶)消除ROS。结果显示,Tempol阻断了 LPS诱导肺癌生长。发现LPS诱导miR-21表达需要ROS,并发现Tempol阻断miR-21与LPS正相关性。为研究在体内LPS诱导肺癌细胞生长中ROS的作用,将含或无Tempol的LPS预处理的肺癌细胞注入裸鼠内,结果显示在体内有Tempol的肺癌细胞抑制了 LPS诱导的肿瘤生长。总之,ROS产生增加是LPS诱导miR-21表达和肿瘤生长是至关重要的。5.在肺癌病人中TLR4表达与miR-21表达和ROS产生具有相关性为证实在临床上这些研究结果,分析了肿瘤组织和正常组织中TLR4和miR-21的表达。结果显示TLR4和miR-21的表达在肿瘤组织中明显增高。进一步分析,未接受治疗的肺癌细胞TLR4、miR-21的表达和ROS水平。分析发现TLR4表达与miR-21表达和ROS水平存在相关性。在肺癌细胞中ROS水平与miR-21表达具有正相关性。这些结果表明在肺癌病人肿瘤进展中存在TLR4/ROS/miR-21通路。结论:在肺癌细胞中,LPS活化TLR4后导致ROS产生增加,又增加miR-21的表达和肿瘤增长。TLR4表达与miR-21表达和ROS水平存在紧密相关性,表明未治疗的肺癌细胞存在TLR4/ROS/miR-21通路。这些结果揭示了个新的机制:革兰氏阴性杆菌能加速肺癌进展,并为治疗肺癌病人提供新的有效治疗措施。