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microRNAs(miRNAs)是一类大小为18-23nt的小分子非编码RNA分子,它们是由具有发夹结构的、70-90个碱基大小的单链miRNA前体(pre-miRNA)经Dicer加工产生。1miRNA在生物界中是广泛存在的,自从第一个miRNA分子在线虫中发现,迄今为止,已发现在人、动物、植物等多种生物中存在。目前,已有超过3,500个miRNA被鉴定,在人体中认识1miRNA的种类也超过了450种。研究发现,miRNA序列不是任意的,在很大的进化距离中具有保守性,提示这种分子在生命活动中可能扮演重要的角色。miRNA在胞浆中与Argonaute等蛋白分子形成miRISC(miRNA induce silencing complex);在miRNA的指引下,miRISC可以特异性的识别mRNA分子的3’端约30碱基长度的非编码区,并以一种不完全匹配的方式结合,抑制mRNA翻译蛋白分子。正是由于这种不完全匹配的结合方式,使得一种miRNA可以同多种mRNA分子结合。人们通过生物信息学手段发现,人类有1/3以上的的蛋白编码基因中都受miRNA调节。miRNA通过调节目的蛋白的表达,在生物体发育、信号传导、凋亡、细胞增殖等生理和病理过程中都发挥重要作用。有研究表明miRNA可能与疾病发生有密切的关系,在不同类型疾病的发生过程中,1miRNA的表达水平及其调节作用是不同的。已有研究发现miRNA与心肌肥厚、心律失常等心血管疾病的发生发展密切相关。动物实验研究表明,大鼠心肌梗死后miRNA-1的表达上调抑制心肌连接蛋白43(connexin43, Cx43)和内向整流钾通道2.1(Kir2.1)的表达而引发室性心律失常。病毒性心肌炎(Viral myocarditis,VMC)是目前严重威胁人们生命健康的最常见的心血管疾病之一,尤其在青年人中猝死率更高,但在非典型VMC致猝死的案件中,常常出现病人突然死亡,临床症状不明显,缺乏临床检查资料,组织病理学表现不明显等矛盾,故非常有必要开发客观、可信的检测手段。本研究以Balb/c小鼠为研究对象,进行了以下四方面的系列研究。第一部分病毒性心肌炎动物模型的建立目的建立小鼠病毒性心肌炎动物模型。方法雄性Balb/c小鼠60只,随机分为2组,分别为7天组(day7,n=30)和15天组(day15,n=30)。每组中任选10只小鼠,腹腔注射不含病毒的Eagel’s培养液(EMEM)作为正常对照；其余20只小鼠腹腔内无菌接种0.1ml10-5TCID50CVB3制作急性、慢性心肌炎动物模型。其后处死小鼠取心脏行组织病理学检查。结果小鼠感染CVB3后第7天为炎症高峰期,病理表现为心肌纤维断裂、心肌细胞变性坏死、间质有大量炎症性细胞浸润,有心肌纤维化发生,但局限在心肌坏死灶周边；第15天末感染小鼠无明显心肌纤维断裂,心肌内炎性细胞浸润减少,心肌间质纤维化明显。结论以CVB3感染Balb/c小鼠成功建立了病毒性心肌炎动物模型。第二部分miR-1在病毒性心肌炎动物模型中的表达以及miR-1下游靶基因的预测目的探讨miRNA-1在病毒性心肌炎小鼠模型心肌组织中的表达变化及潜在调节机制预测。方法取正常对照组10例小鼠心脏组织标本,20例注射10-5TCID50CVB37天VMC组小鼠心脏组织标本,实时定量PCR(Real-time PCR)法检测小鼠心肌组织中miRNA-1的改变；利用miRNAbase, Targetscan等预测软件,综合分析相关因素,筛选miRNA-1的调控靶点。结果通过RT-PCR法定量检测VMC小鼠心肌组织miRNA-1表达水平,结果发现与对照组比较,VMC组心肌组织miRNA-1表达水平明显升高为对照组的3倍(表达水平：10+2.5vs.31+7.6,P<0.05)；利用.miRNAbase, Targetscan等预测软件,综合分析相关因素,筛选出miR-1与Cx43调控靶点。结论Balb/c小鼠VMC动物的心肌组织miRNA-1表达水平上调了200%,Cx43的3’-UTR有两个miR-1的结合位点,miR-1可能是Cx43的调控靶点。第三部分Cx43在病毒性心肌炎动物模型中的表达目的Cx43在病毒性心肌炎动物模型心肌组织中的表达。方法利用real-time PCR、Western blot、免疫组化等技术检测VMC组和对照组小鼠心肌细胞中Cx43基因、蛋白表达情况。结果免疫组化证明正常对照组Cx43主要分布于心肌细胞闰盘处,VMC组中Cx43表达显著降低,且分布于细胞膜侧面；Western blot显示VMC组小鼠心肌组织Cx43相对含量均明显低于对照组(0.27+0.10VS.0.60+0.13,P<0.05),但mRNA水平无明显变化。结论连接蛋白43(Cx43)在病毒性心肌炎动物模型心肌组织中的表达显著降低。第四部分心肌细胞中miR-1对Cx43表达的调节目的在原代心肌细胞中miR-1对Cx43表达的调节作用。方法将慢病毒包装的miRNA-1、抑制子AMO-miR-1转染入原代心肌细胞中,以分别提高和降低细胞内相应miRNA的水平,检测心肌细胞中Cx43蛋白水平变化情况。结果在原代心肌细胞中过表达miR-1,Cx43蛋白表达随之降低,但转录水平未发生明显改变,miR-1能在转录后水平抑制Cx43蛋白的表达水平。结论miR-1能在转录后水平抑制Cx43蛋白的表达水平。