引言食管鳞状细胞癌(简称食管鳞癌)是严重危害人民健康及生命的恶性肿瘤之一。2015年度,我国食管癌的新增发病人数及致死人数均占所有肿瘤新增发病总人数及致死总人数的10%以上,而食管鳞癌在所有类型的食管癌中占70%以上。肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSCs)是指存在于肿瘤组织中的具有无限增殖和不定向分化潜能的细胞群体。这些极少量的细胞可形成各种分化程度的肿瘤细胞,并导致肿瘤细胞不断增殖、转移,从而造成患者预后不良。南蛇藤(Celastrus orbiculatus Thunb.)是我国重要的民间药用植物,主要用于治疗腰腿痛、风湿性关节炎等疾病。近年来,已有许多研究证实南蛇藤茎乙酸乙酯提取物(C.orbicutats ethyl acetate extract,COE)具有显著的抗肿瘤活性。课题组前期研究中发现COE可抑制食管鳞癌细胞的增殖并诱导细胞凋亡及周期阻滞,然而COE是否能抑制食管鳞癌侵袭及转移尚不清楚,且关于COE能否抑制肿瘤干细胞的研究更是少之又少。本课题拟在前期实验的基础上进一步研究COE对人食管鳞癌细胞侵袭及转移的影响。并利用无血清悬浮培养建立肿瘤干细胞模型,研究COE对人食管鳞癌干细胞侵袭及转移的影响并利用蛋白质组学技术筛选其作用靶点。利用分子克隆技术构建该靶点蛋白过表达及低表达细胞模型,结合临床食管鳞癌手术标本深入分析该蛋白在食管鳞癌中的意义及可能作用机制,从而探明COE通过该蛋白影响肿瘤干细胞抑制人食管鳞癌侵袭转移的具体分子机制,为开发新型抗食管鳞癌药物提供新的策略和理论依据。本课题共分为四部分研究内容。第一部分:南蛇藤提取物通过DJ-1抑制人食管鳞癌细胞迁移、侵袭及肿瘤干样细胞增殖目的:观察COE对人食管鳞癌细胞的侵袭、迁移能力、EMT进程及干细胞转录因子mRNA水平的影响;构建食管鳞癌干细胞模型,筛选COE作用于人食管鳞癌肿瘤干细胞模型的蛋白靶点。方法:体外培养人食管鳞癌细胞ECA-109及TE-8细胞,不同浓度(10,20,40,80,160,320 μg/mL)的COE对作用于细胞24h、48h、72h后,MTT法检测COE对细胞生长增殖的影响。普通显微镜观察COE对细胞形态的影响。Transwell小室实验、western blot及RT-qPCR分别检测分别检测COE对两株细胞侵袭、迁移能力及细胞中蛋白水平与mRNA表达的影响。通过无血清培养基(serum-freemedium,SFM)悬浮培养富集人食管鳞癌干样细胞,并以CD90、CD133及SOX2、Nanog、OCT4的mRNA表达变化及细胞在裸鼠体内成瘤能力来鉴定其干性。MTT实验用于检测COE对干样细胞增殖能力的影响。蛋白质组学技术用于筛选COE(80 μg/mL)作用于该细胞模型的差异蛋白点。结果:不同浓度的COE作用ECA-109及TE-8细胞24h、48h、72h后,细胞的生长呈现不同程度的抑制,并呈一定的浓度及时间依赖性(P<0.05);其24hIC50分别为139.17±13.95μg/mL,153.74±10.72 μg/mL。20、40、80 μg/mL 浓度的 COE 及阳性对照药 5-Fu 作用 ECA-109及TE-8细胞24h后,随着COE浓度的增加,细胞形态呈凋亡状改变。且COE能抑制ECA-109及TE-8细胞迁移及侵袭能力,并呈浓度依赖(P<0.05)。随着COE浓度的升高,E-cadherin表达而逐渐上调,而N-cadherin表达逐渐下调,提示COE可以抑制EMT的发生。RT-qPCR结果提示COE可以降低干细胞转录因子SOX2、Nanog及OCT4的mRNA水平,呈浓度依赖(P<0.05)。成功富集人食管鳞癌干样细胞(ECA-109-S),且富集后第14天细胞内CD90及CD133表达及SOX2、Nanog及OCT4的mRNA水平较正常血清培养中的细胞高(P<0.05)。裸鼠体内成瘤实验证实低数量级的ECA-109-S细胞同样能够成瘤,且2×104 ECA-109-S细胞形成的皮下移植瘤体积明显大于2×106 ECA-109细胞形成的瘤体积。MTT结果显示COE可以抑制该细胞群增殖,呈浓度依赖(P<0.05)。通过蛋白质组学实验成功鉴定出5个差异蛋白,分别为α-骨架蛋白(α-tubulin)、Stomatin-like2(SLP-2)、抗增殖蛋白(Prohibitin)、帕金森蛋白 7(Parkinson disease protein 7,PARK7,DJ-1)、热休克蛋白 27(heat shock protein 27,HSP27)。结论:COE可以抑制人食管鳞癌ECA-109及TE-8细胞增殖、侵袭、EMT及ECA-109干样细胞增殖,其作用的蛋白靶点为可能是α-tubulin、SLP-2、Prohibitin、DJ-1、HSP27等靶点蛋白单独或共同参与的结果。第二部分:DJ-1通过Wnt/β-catenin信号通路促进人食管鳞癌细胞增殖及转移目的:该部分主要探讨DJ-1在人食管鳞癌细胞增殖及转移中的作用,并对其潜在机制进行了探讨。方法:通过免疫组织化学检测DJ-1,Vimentin和E-cadherin在84例人食管鳞癌标本中的表达水平,分析各蛋白的表达与临床病例基线资料是否有统计学意义及这三个蛋白之间的相关性。利用TGF-β1建立EMT模型,分析DJ-1的表达水平。利用慢病毒载体构建DJ-1过表达及低表达细胞模型,并用Wnt/β-catenin抑制剂XAV939干预过表达DJ-1的细胞,通过Edu增殖实验、克隆实验、transwell小室实验及western blot分别检测细胞增殖、克隆、迁移、侵袭能力和细胞中各蛋白水平。利用DJ-1过表达及低表达细胞构建裸鼠腹腔转移瘤模型,观察各组肿瘤转移情况,免疫组织化学方法分析瘤组织中DJ-1等蛋白表达。结果:在84例食管鳞癌标本中,DJ-1的表达与淋巴结转移和远处转移密切相关,而Vimentin和E-cadherin与肿瘤细胞分化、肿瘤浸润深度、淋巴结转移和远处转移有关(P<0.05)。且DJ-1的表达水平与Vimentin表达呈正相关,r=0.739,P<0.001,而与E-cadherin表达呈负相关,r=-0.770,P<0.001。在TGF-β1诱导的ECA-109细胞EMT模型中,DJ-1表达水平较ECA-109细胞明显增高(P<0.01)。成功构建过表达DJ-1的重组细胞株ECA-109-LV-DJ-1,沉默表达DJ-1的细胞株ECA-109-LV-siRNA-DJ-1及其各自的阴性病毒对照组细胞。ECA-109-LV-DJ-1细胞增殖、克隆、迁移、侵袭能力均强于对照组细胞(P<0.05)。在 ECA-109-LV-DJ-1 细胞中,E-cadherin 表达降低,而 N-cadherin 和 Vimentin 表达增加;Wnt/β-catenin信号通路中LRP6、p-LRP6、β-catenin表达水平增高,Axin1表达水平降低(P<0.05)。而沉默表达DJ-1后,细胞增殖、克隆、迁移、侵袭能力及蛋白表达结果与ECA-109-LV-DJ-1细胞中相反。XAV939干预ECA-109-LV-DJ-1细胞后,细胞增殖、克隆、迁移、侵袭能力明显减弱(P<0.05),且EMT进程及Wnt/β-catenin信号通路传导受到抑制(P<0.05)。裸鼠腹腔转移瘤实验结果显示过表达DJ-1后,细胞具有更强的转移能力,且瘤组织中Vimentin及β-catenin表达增加,E-cadherin表达减少;而沉默DJ-1后,细胞转移能力减弱,Vimentin及β-catenin表达减少,E-cadherin表达增加(P<0.05)。结论:DJ-1通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进人食管鳞癌ECA-109细胞增殖、黏附、迁移、侵袭和EMT进程。第三部分:DJ-1通过促进线粒体生成及呼吸维持人食管鳞癌细胞干细胞特性目的:该部分主要探讨DJ-1在维持人食管鳞癌细胞干细胞特性中的作用,并对其潜在机制进行了探讨。方法:通过免疫组织化学检测DJ-1、SOX2和Nanog在84例人食管鳞癌标本中的表达水平,并分析其相关性。利用无血清培养建立肿瘤干细胞模型、慢病毒载体构建DJ-1过表达及低表达细胞模型。细胞成球实验、流式细胞分析、RT-qPCR分别用于检测细胞成球能力、细胞表面标记CD90、CD133的表达及干细胞转录因子SOX2、Nanog及OCT4的变化。Mito-TrackerRed染色用于分析线粒体质量,荧光观察及流式分析用于线粒体膜电位的测定,透射电镜用于观察各组细胞内的线粒体数目及结构,ATP检测试剂盒用于检测细胞内总ATP产量,流式细胞分析用于检测DCFH-DA标记的细胞内总ROS含量,westernblot用于检测细胞中各蛋白水平。利用DJ-1过表达及低表达细胞模型构建裸鼠皮下移植瘤模型,绘制肿瘤体积增长曲线,并分析各组瘤重,免疫组织化学方法检测移植瘤中DJ-1及Nanog等蛋白表达。结果:在84例人ESCC组织标本中,SOX2的表达与肿瘤浸润深度、淋巴结转移和远处转移密切相关,而Nanog的表达与肿瘤细胞的分化、肿瘤浸润深度、淋巴结转移和远处转移有关。且DJ-1的表达与干细胞转录因子Nanog(r=0.685,P<0.001)和SOX2(r=0.620,P<0.001)的表达正相关。过表达DJ-1后,细胞具有更强的成球能力及体内成瘤能力,及更高水平的 CD90、CD133 标记及 Nanog、OCT4、SOX2mRNA 表达(P<0.05)。而 DJ-1表达减弱后,以上能力均减弱。无血清培养后的细胞具有更强的线粒体质量、数量,更高表达的PGC-1α mRNA、ATP产量、线粒体膜电位(P<0.05),而细胞内总ROS含量并无明显变化。此外,线粒体质量、PGC-1α mRNA、ATP产量在过表达DJ-1细胞中增加而在低表达细胞中明显减弱(P<0.05)。过表达DJ-1细胞中线粒体数目增多(P<0.05),低表达DJ-1细胞中线粒体数量没有明显变化,但是线粒体形态出现明显破坏,表现为线粒体的肿胀,嵴排列紊乱并消失。且削减DJ-1表达的细胞中总ROS含量明显增多。同时DJ-1过表达可以增加线粒体相关蛋白PGC-1α、VDAC、Cyt-C的表达,而削减DJ-1表达后,PGC-1α、VDAC、Cyt-C 表达明显降低(P<0.05)。结论:DJ-1通过促进线粒体生成及呼吸维持人食管鳞癌细胞干细胞特性。第四部分:南蛇藤提取物通过DJ-1介导的线粒体生成调控人食管鳞癌干样细胞侵袭转移目的:观察COE对人食管鳞癌干样细胞干性能力及侵袭转移的影响,并探索其可能的作用机制。方法:细胞分为野生细胞对照组,干样细胞阴性对照组及干样细胞加各浓度药物组。Transwell小室实验分别检测不同浓度COE对细胞侵袭、迁移能力的变化。Western blot及RT-qPCR分别用于检测各组细胞中蛋白及mRNA水平的变化。透射电镜用于观察各组细胞内的线粒体数目及形态结构,Mito-TrackerRed染色用于分析线粒体质量,流式分析用于线粒体膜电位的测定。构建裸鼠腹腔转移瘤模型,将注射ECA-109-S细胞的裸鼠随机分为对照组(含1%DMSO的生理盐水溶液),COE低(10mg/kg)、中(20mg/kg)、高(40 mg/kg)剂量组,替吉奥(10 mg/kg)组,各组裸鼠均灌胃给药,观察各组裸鼠的腹膜种植转移的情况。应用免疫组织化学的方法检测各组裸鼠的肿瘤组织中DJ-1、E-cadherin、Nanog及PGC-1α的表达水平。结果:食管鳞癌干样细胞的迁移及侵袭能力明显强于野生细胞,而COE可以抑制食管鳞癌干样细胞的迁移及侵袭能力,并呈浓度依赖,并上调细胞中E-cadherin的表达,下调N-cadherin及Vimentin的表达(P<0.05)。透射电镜结果显示80 μg/mL COE可以减少干样细胞中线粒体的数量(P<0.05),并使线粒体结构发生改变,表现为线粒体肿胀,内膜消失,嵴排列紊乱。Mito-Tracker Red染色结果显示80 μg/mL COE可明显降低线粒体质量(P<0.05)。COE可以降低ECA-109-S细胞中的线粒体膜电位,并减少DJ-1及线粒体相关蛋白PGC-1α、HSP60、VDAC等的表达,呈浓度依赖(P<0.05)。体内实验显示,COE各剂量组中裸鼠的活动及生长状态均明显好于对照组。COE各剂量组中,肿瘤在大网膜、肠系膜、肝脏的转移发生率明显小于对照组(P<0.05)。免疫组化结果表明COE可明显上调移植瘤组织中E-cadherin的表达,下调DJ-1、Nanog及PGC-1α蛋白的表达。结论:COE可抑制人食管鳞癌干样细胞侵袭及转移,其作用机制可能与COE调控DJ-1介导的线粒体生成有关。