【目的】中国目前有超过1亿人口患糖尿病,糖尿病肾病(Diabetic nephropahty,DN)是糖尿病最常见的微血管并发症之一,也是引起终末期肾病的首要原因。微量蛋白尿是早期发现DN和指导临床治疗DN的重要指标。有效的药物治疗并减少蛋白尿的产生对改善DN的进程尤为重要。红景天苷(Salidroside,SAL)是天然植物红景天(Rhodiola Rosea)的主要成分。最近报道红景天苷可以抑制高糖所致的系膜细胞增生,红景天的醇提取物对DN有保护作用,然而红景天苷是否对DN有保护作用还不清楚。本课题主要是探究红景天苷能否缓解糖尿病相关蛋白尿并探讨其中的机制。肾小球内皮细胞(Glomerular endothelial cell,GECs)是肾小球滤过膜的第一道屏障,在蛋白尿发生中有重要作用。由于GECs也是内皮细胞,同时考虑到小窝蛋白(Caveolin-1,Cav-1)在白蛋白跨血管内皮的穿胞中有重要作用,而且在Cav-1-/-鼠没有观察到蛋白尿,人和鼠的肾脏内皮均有Cav-1的表达,我们猜想白蛋白是否也是通过跨GECs穿胞从而产生蛋白尿。为了便于研究蛋白尿产生的机制,我们首先建立了白蛋白体外穿胞模型。同时,我们采用国际公认的糖尿病肾病模型鼠(db/db鼠)探索红景天苷能否缓解其肾脏病变和蛋白尿,利用建立的白蛋白体外穿胞模型研究其机制,并进一步探究其上游的信号通路。【方法】1.建立白蛋白体外穿胞模型用异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocyanate,FITC)代替放射性物质标记白蛋白,便于示踪观察白蛋白穿胞。利用穿胞是由受体介导的并高度受调控的原理,建立白蛋白体外穿胞模型。2.动物实验采用国际公认的糖尿肾病模型db/db鼠(雄性,9周龄),用二甲双胍(200 mg/kg/day)、红景天苷(25,50,100mg/kg/day)、甲基-β-环糊精(mβcd,100mg/kg/week)、n-乙基马来酰亚胺(nem,1.7mg/kg/week)或者生理盐水处理小鼠11周(n=12~15)。同时,雄性9周龄db/m鼠为非糖尿病肾病组(wt组)进行对照实验,给予等量的生理盐水处理11周。药物处理11周后,尾静脉采血检测餐后2h血糖;用代谢笼收集小鼠24h尿液储存备用;小鼠麻醉后,收集血液和肾脏标本。用试剂盒检测血肌酐、尿肌酐;用酶联免疫吸附测定(enzyme-linkedimmunosorbentassay,elisa)试剂盒检测尿微量白蛋白,并计算尿白蛋白/尿肌酐比值;新鲜肾脏组织用4%多聚甲醛固定后包埋、切片,行过碘酸雪夫染色(periodicacid-shiffstain,pas),检测肾脏肾小球及系膜的形态学改变。3.细胞实验利用建立的白蛋白体外穿胞模型,进一步探讨红景天苷在低糖和高糖情况下对白蛋白跨gecs穿胞的影响,同时检测穿胞的相关分子对白蛋白跨gecs穿胞的影响;用westernblot方法在gecs中检测腺苷酸活化蛋白激酶(adenosinemonophosphateactivatedproteinkinase,ampk)、src和cav-1等蛋白的磷酸化情况来研究白蛋白穿胞的相关调节通路,以及在红景天苷抑制白蛋白跨gecs穿胞中的调控作用;用ampksirna和cav-1sirna转染细胞分别下调ampk和cav-1蛋白的表达,进一步证实其在穿胞中的作用以及与红景天苷抑制白蛋白穿胞的关系;用mitosoxtmred探针和jc-1探针分别检测线粒体活性氧(mitochondrialreactiveoxygenspecies,mtros)和线粒体膜电位的变化,进一步探讨线粒体超氧化物的产生和线粒体膜电位与白蛋白穿胞的关系以及在红景天苷抑制白蛋白穿胞中的作用;细胞摄取白蛋白实验进行形态学观察白蛋白穿胞的中间状态,进一步证实红景天苷与穿胞的相关分子的作用。【结果】1.建立白蛋白体外穿胞模型(1)用fitc代替放射性物质成功标记白蛋白,并具有稳定性和可操作性。(2)成功建立白蛋白体外穿胞模型。模型成功的关键必须考虑器材孔径的选择、荧光示踪剂的选择、区分穿胞的白蛋白与细胞间隙漏出的白蛋白、白蛋白影响渗透压、白蛋白的代谢等因素。(3)我们的结果发现fitc-albumin穿胞的量具有浓度依赖性和时间依赖性。该模型的建立为临床上蛋白尿的发生提供了直接的实验依据;可用于研究其他大分子物质的穿胞;还可用于体外药物筛选,筛选降低白蛋白尿的药物。2.红景天苷能明显缓解db/db小鼠糖尿病肾病(1)在动物实验中,与db/m对照组相比,db/db鼠血糖、左肾重、血肌酐、尿白蛋白/尿肌酐等指标明显增加(p<0.05orp<0.01),肾小球体积和肾小球系膜增加,符合糖尿病肾病模型特征。(2)红景天苷处理动物后能显著降低血糖、左肾重、血肌酐、尿白蛋白/尿肌酐等指标(p<0.05orp<0.01)。意外的是,二甲双胍虽然可以降低db/db鼠血糖水平,但是不能减少db/db鼠尿白蛋白/尿肌酐的比值。穿胞抑制剂mβcd和nem对血糖和血肌酐没有明显影响,仅降低db/db鼠尿白蛋白/尿肌酐的比值。(3)与肾脏功能指标相一致的是,肾脏pas染色结果显示红景天苷可以减少db/db鼠肾小球表面积和肾小球系膜面积,缓解肾脏形态学改变,而二甲双胍、mβcd和nem对db/db鼠肾脏的形态学改变没有明显的影响。3.红景天苷可通过减少白蛋白跨gecs穿胞来抑制蛋白尿的产生及其机制研究(1)在细胞实验中,利用建立的白蛋白体外穿胞模型,结果发现红景天苷能剂量依赖性的明显减少低糖和高糖情况下白蛋白跨gecs穿胞,然而二甲双胍增加低糖情况下白蛋白的穿胞,对高糖时白蛋白穿胞的影响不明显。mβcd和nem能减少低糖和高糖情况下白蛋白跨gecs穿胞。(2)在穿胞模型中,结果发现ampk的激动剂aicar、src的抑制剂pp2均抑制高糖情况下白蛋白的穿胞,同时ampk的抑制剂compoundc可以部分恢复红景天苷抑制白蛋白在高糖时的穿胞。(3)westernblot检测发现红景天苷可以剂量依赖性的促进ampk磷酸化,同时还能抑制src和cav-1的磷酸化;用cav-1sirna转染细胞后,结果发现cav-1表达减少的同时也抑制了白蛋白的穿胞。(4)src/cav-1途径和ampk/cav-1途径均参与红景天苷抑制白蛋白穿胞:westernblot检测发现高糖刺激可以抑制ampk磷酸化并且激活src激酶和cav-1,这两者都能增加Cav-1介导的白蛋白穿胞;红景天苷可以剂量依赖性的逆转高糖引起的AMPK、Src以及Cav-1活性的改变;用AMPK siRNA转染细胞后,结果发现AMPK表达减少的同时Cav-1磷酸化增加,而且还促进了白蛋白的穿胞;AMPK siRNA还能部分抑制红景天苷阻断高糖上调Cav-1磷酸化的效应,但是对红景天苷阻断Src的磷酸化没有影响。(5)Western blot检测发现二甲双胍能激活低糖和高糖时的AMPK,但是与红景天苷不一样的是,二甲双胍促进了低糖时Src和Cav-1的磷酸化,对高糖时Src激酶和Cav-1的磷酸化水平没有明显影响。(6)Western blot检测发现活性氧清除剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)可以抑制高糖时Src和Cav-1的活性。MitoSOXTM Red探针检测发现高糖促进mtROS产生,NAC减少高糖时mtROS的产生,红景天苷可以减少低糖和高糖时mtROS的产生;不同的是二甲双胍增加低糖时mtROS的产生,对高糖时mtROS没有明显影响。JC-1探针检测发现高糖使线粒体膜电位超级化,红景天苷、二甲双胍、NAC、线粒体电子传递链抑制剂CCCP都能使细胞线粒体膜电位去极化。(7)白蛋白摄取实验进行形态学观察白蛋白穿胞的中间状态,结果进一步证实红景天苷抑制白蛋白穿胞及穿胞的相关蛋白的作用。【结论】红景天苷通过减少白蛋白跨GECs穿胞缓解蛋白尿的产生。高糖加重白蛋白穿胞的作用是通过上调ROS/Src/Cav-1途径以及下调AMPK/Cav-1途径实现的。红景天苷阻止高血糖引起白蛋白穿胞的机制是通过其抗氧化效应和激活AMPK的双重作用实现的。