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丙型肝炎病毒(HCV)是一个由脂膜包裹的正链RNA病毒,RNA分子全长约9.6kb。HCV已经成为慢性肝病最重要的病因之一,HCV慢性感染可导致肝脏慢性炎症坏死和纤维化,部分患者可发展为肝硬化甚至肝细胞癌(HCC),对患者的健康和生命危害极大,已成为严重的社会和公共卫生问题。但目前,治疗丙肝的药物比较昂贵且疗效差,还有一些不良反应,针对此情况,开发治疗丙型肝炎的新药已迫在眉睫。
HCV的基因类型很多,且它们的核酸差异很大,这给设计新药带来不便。但它也有相对保守的地方,如5’端非翻译区的内部核糖体进入位点(IRES)就是其中之一。而且研究发现IRES的Ⅲd区域在HCV遗传过程中发挥重要作用。因此,该点可作为设计新药的靶位点。目前,对RNA适配体的实验研究也很多,其中也发现RNA适配体有一般药物无法比拟的优势。针对HCV IRES Ⅲd区域设计的RNA适配体有反义的和随机的两种,研究表明这两种适配体都对HCV有很好的抑制作用。但对RNA适配体的研究多集中在序列方面,对于适配体的结构研究相对较少,特别是空间结构的研究基本处于空白。
针对此种情况,论文在HCV IRES NMR所测结构的基础上,利用InsightlI构建HCV IRES Ⅲd区域与其RNA适配体之间相互作用的模型,所涉及的RNA适配体包括:3-07适配体及其I(活性位点nt46-50ACCCA突变为LJGGGIJ)、Ⅱ(nt51-56CCUUUC突变为GGAAAG)、Ⅲ(删除nt47-50)三个突变体。然后用Biopolymer、Discover和DelPhi模块对模型中二分子表面之间的结合自由能、氢键和静电相互作用进行分析,以探讨构建模型的合理性与RNA适配体空间结构在与靶位点结合时所发挥的作用。
通过对所构建四个模型的比较分析表明,3-07:RNA适配体及其突变体III与Ⅲd靶位点的空间结构形成很好的匹配,而且它们之间形成的氢键数最多,活性位点之间形成的静电作用也最强。经活性位点碱基替换的突变体I,其空间结构与3-07RNA.适配体相比有所改变,在活性位点处形成的孔穴变小,同时活性位点表面形成部分负电荷,从而导致突变体I与Ⅲd之间的空间匹配、氢键和静电相互作用都不如前二者好。突变体Ⅱ nt51-56处碱基改变后,它的结构完全改变,这使它与Ⅲd之间形成的空间匹配最差、氢键数最少。虽然它的活性位点表面形成的是正电荷,但由于它与靶位点接触面积小,使它们形成的静电相互作用比较弱。所以3-07适配体、突变体Ⅲ与Ⅲd之间的结合力最强,突变体1次之,而突变体Ⅱ与Ⅲd之间的结合力最差。这与实验中所显示出的四个适配体引入表达系统后对酶的抑制作用效果的影响相吻合,实验中3-07与突变体Ⅲ可将酶活性抑制到10%左右,而突变体I和Ⅱ则几乎没有什么抑制效果。由此可以推测,所构建的模型是合理的,且RNA适配体的空间结构在与靶位点结合时发挥关键而重要的作用,改变适配体的结构会影响二者之间的空间匹配、氢键作用以及静电相互作用,从而导致二者之间的结合力下降,影响靶分子的作用效果。论文工作为RNA适配体的筛选从理论上提供一种思路。