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脂多糖(LPS)是外膜外层的重要组成结构,可被TLR4受体识别,引发炎性细胞因子释放。类脂A是LPS的重要组成成分,是脂多糖的活性中心,因此具备被开发成疫苗佐剂的潜力。为了开发新型类脂A类疫苗佐剂,实验室已经构建出了类脂A改造菌株HW001、HW002、HW003和HW004。类脂A很大程度上影响着外膜特性,所以类脂A的结构影响着致病菌的毒性。酰基脂肪酸转移酶LpxD是类脂A合成过程中的第三步酶,转移羟基脂肪酸链到特定的位置上。弗朗西斯菌是致病性很强的革兰氏阴性菌,这与其类脂A有一定关系。之前研究在弗朗西斯菌中发现了两种酰基脂肪酸转移酶:LpxD1和LpxD2,并且这两种酶对底物选择性存在差异,分别敲除lpxD1基因和lpxD2基因构建lpxD1-null和lpxD2-null突变株发现,类脂A脂肪酸链组成发生变化,lpxD1-null突变株对小鼠毒性减弱。本课题揭示了酰基脂肪酸转移酶对菌体毒性的影响;通过表达lpxD1和lpxD2的研究了两种酶在大肠杆菌中对脂肪酸链的选择性和两种酶对菌体合成的类脂A的免疫活性和菌体外膜特性的影响;通过在实验室原有的类脂A结构相关的突变株中表达LpxD1来分析不同类脂A结构变化组合对LPS的生物活性的影响。具体研究成果如下:(1)通过多级质谱鉴定了F.novicida、lpxD1-null突变株和lpxD2-null突变株的类脂A结构。并通过环境耐受性的比较、TLR4刺激程度的比较、胞内复制能力的比较和菌体对细胞毒性的比较分析了酰基脂肪酸转移酶对弗朗西斯菌毒性的影响。lpxD1-null突变株对环境更敏感,不具有胞内增殖能力,对细胞的毒性降低;(2)通过在E.coli RL25中表达lpxD1和lpxD2,构建出RL25/pUC-lpxD1和RL25/pUC-lpxD2,以导入空载质粒的菌体RL25/pUC为对照,发现在大肠杆菌LpxD1可以以3-OH-C18和3-OH-C16脂肪酸链为底物,LpxD2可以以3-OH-C16脂肪酸链为底物,并且与RL25/pUC相比,RL25/pUC-lpx D1和RL25/pUC-lpxD2两种菌体外膜渗透性、自凝集能力与抗生素敏感性均降低,疏水性增强。通过菌体直接刺激HEK-Blue hTLR4细胞,LPS刺激RAW267.4和THP-1细胞,发现RL25/pUC-lpxD1和RL25/pUC-lpxD2免疫活性均有所下降,RL25/pUC-lpxD1的LPS和RL25/pUC-lpxD2的LPS免疫活性也都有所下降;(3)在实验室原有菌株W3110、HW001、HW002、HW003和HW004中表达了lpxD1,质谱鉴定发现类脂A中添加了更长的羟基脂肪酸链;菌体直接刺激HEK-Blue hTLR4细胞,LPS刺激小鼠RAW267.4细胞和人THP-1细胞,比较了表达菌株与对照菌株的类脂A活性变化,表达lpxD1后,免疫活性均有不同程度的下降。