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目的：在前期实验研究及“断体地龙假说”的基础上,筛选验证地龙最佳断体时间,研究影响断体地龙提取液稳定性的因素,分离断体地龙中的活性成分,初步探究地龙中活性成分促进创伤愈合的作用机制。方法：1.采用体外活性筛选CCK-8法,通过测定地龙再生期(断体后0-7天)提取液促进HaCaT细胞的增殖率,确定地龙最佳断体时间。通过HPCE及SDS-PAGE方法比较不同天数的地龙样品差异。2.建立皮肤细胞(成纤维细胞、表皮细胞、血管内皮细胞)培养方法,研究DL3对其增长的影响,采用镜检方法以及体外活性筛选CCK-8法,测定成纤维细胞、表皮细胞、血管内皮细胞的增殖活性,计算皮肤细胞的增殖率,并绘制其增殖率曲线,分析样品对皮肤细胞增殖的影响。3.采用NIH3T3细胞活性筛选的方法,比较不同pH处理后的活性蛋白溶液活性,绘制pH与增殖率曲线,观察活性蛋白的pH耐受范围；比较不同温度处理后蛋白溶液活性,绘制温度与增殖率曲线,观察活性蛋白的温度耐受范围。4.地龙样品盐析分段处理,通过其对HaCaT及NIH3T3细胞的增殖率的比较,选择出增殖率较强的盐析组分,采用小鼠皮肤线性创伤模型进行活性筛选,皮肤组织HE染色与免疫组化分析,观察创伤部位组织愈合情况及生长因子表达情况,比较创伤愈合过程中给药组与对照组小鼠皮肤愈合情况之间的差异,选择出促进愈合效果最佳组分,并通过SDS-PAGE对盐析组分进行分析,确定其分子量分布情况。结果：1.断体地龙提取液中产生的修复物质对HaCaT细胞有促进其增生的作用,且在0-5天时,其促进增殖效果较好,断体6天后,其促进HaCaT细胞增殖的作用减弱,说明在断体后不同时间,地龙产生的促进创伤愈合的物质效果不同,其中DL3的效果最佳,因此最佳断体时间选择为3天。从HPCE和SDS-PAGE的结果来看,断体不同天数的地龙提取液成分及含量上都存在一定差异。2.DL3对NIH3T3细胞及HaCaT细胞有一定的促增殖作用,很有可能与其促进创面愈合的机制有一定关系,而DL3对HUVEC细胞无明显增殖作用。3.DL3经不同pH处理后的蛋白溶液仅在pH=7时仍具有较好的生物活性,经不同温度处理后的蛋白溶液在0-30℃C时能具有较好的生物活性。DL3的保存条件应置于低温,中性pH环境。这为地龙将来的成药处理及其储存做了前期研究,为将来药物的大量生产及储存奠定了基础。4.通过体外细胞活性筛选与体内创伤模型筛选,发现DL3-1与DL3-4这两个组分对NIH3T3细胞及HaCaT细胞的增殖效果较好,HE染色和免疫组化分析发现,DL3-1与DL3-4这两个给药组的创面恢复效果较好,创面FGF及VEGF生长因子表达与对照组相比有显著性差异,且通过SDS-PAGE分析了DL3-1与DL3-4中的蛋白质的分子量范围。