论文部分内容阅读
目的:研究通过2′,5′-ADP-琼脂糖凝胶亲和沉淀法富集内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)后检测eNOS氧连接的N-乙酰葡萄糖胺(O-linked Nacetylglucosamine,O-GlcNAc)糖基化表达的方法及该方法在2型糖尿病大鼠模型中的应用。方法:检测2′,5′-ADP-琼脂糖凝胶亲和沉淀法在牛主动脉内皮细胞(Bovine aortic endothelial cells,BAECs)总蛋白裂解液中对eNOS的富集效率;蛋白质印迹法(Western blot)结合抗O-GlcNAc一抗检测BAECs及大鼠主动脉组织蛋白中eNOS O-GlcNAc糖基化的表达水平;2型糖尿病大鼠模型的建立;前述方法应用于2型糖尿病大鼠主动脉组织的eNOS O-GlcNAc糖基化表达水平的检测。结果:2′,5′-ADP-琼脂糖凝胶亲和沉淀法在BAECs总蛋白裂解液中对eNOS的富集效率大于80%;BAECs和大鼠主动脉组织总蛋白裂解液中的eNOS经过2′,5′-ADP-琼脂糖凝胶亲和沉淀法富集后,eNOS O-GlcNAc糖基化的表达量与BAECs和大鼠主动脉组织蛋白总量成正比例的线性关系,证明在一定蛋白总量范围内,该方法有效;糖尿病组大鼠的空腹血糖和胰岛素抵抗指数均高于正常组(P>0.05),体重低于正常组(P>0.05);糖尿病组大鼠主动脉组织中的eNOS O-GlcNAc糖基化表达水平相比正常组有明显上调(P>0.05)。结论:相比免疫沉淀的方法,通过2′,5′-ADP-琼脂糖凝亲和沉淀的途径检测eNOS O-GlcNAc糖基化表达的方法更简单、高效、并能有效的应用于内皮细胞以及正常或疾病动物模型中的主动脉组织。