丝胶所占比例对丝素/丝胶多孔支架结构和性能的影响

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蚕丝丝素多孔材料作为皮肤、脂肪、骨等组织工程支架具有广阔的研发及应用前景。用于不同的组织修复时,对丝素多孔支架的微观结构、力学性能及生物降解速度有不同的要求。用蚕丝丝胶与丝素共混是调节丝素多孔支架结构和性能的可能途径。系统性地研究丝素/丝胶多孔支架中丝胶所占比例对支架微观结构、力学性能、生物降解速度及细胞生长的影响,并探讨因引入丝胶而可能产生的风险,是用丝胶调节丝素多孔支架结构、性能,以期应用于不同组织修复的前提。基于此目的,本研究用丝胶与丝素共混,借助冷冻干燥技术制备丝素/丝胶共混比例不同的多孔支架,研究丝素/丝胶比例对支架内部孔结构及力学性能、生物降解速度的影响,以及对人脐静脉血管内皮细胞、巨噬细胞生长的影响。并测定支架内细菌内毒素的含量,初步评估因丝胶共混对支架可能造成的生物相容性风险。首先,将丝素与丝胶蛋白溶液共混,聚乙二醇二缩水甘油醚作为交联剂,通过冷冻干燥技术制备出丝胶占比不同的丝素/丝胶多孔支架材料,探讨丝胶占比对丝素/丝胶多孔支架材料内部孔结构及理化性能的影响。氨基酸分析结果表明,丝素/丝胶多孔支架材料经聚乙二醇二缩水甘油醚交联后,其氨基酸组成中天门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸的含量比未交联的多孔支架材料有所下降,表明聚乙二醇二缩水甘油醚两端的环氧基团能够与天门冬氨酸和谷氨酸侧链上的羧基及丝氨酸侧链上的羟基反应,将丝素/丝胶多孔支架交联,达到难溶于热水的目的。对丝素/丝胶共混多孔支架孔壁结构进行详尽的观察和分析发现,因丝胶的混入,在多孔支架的内部产生了大量孔径为32.25~65.98μm的次级孔,在孔壁上产生了大量粒径为249.38~555.94nm的颗粒状凸起,随着丝素/丝胶共混支架中丝胶占比的增多,次级孔增多,颗粒状凸起的粒径增大。丝素/丝胶共混多孔支架中的无规卷曲结构随丝胶占比的增多而增多,支架的抗压强度随丝胶占比的增多而显著下降,弹性模量也有所降低。其次,用蛋白酶ⅩⅣ的缓冲溶液对丝素/丝胶质量比不同的共混支架进行体外降解实验,研究丝胶占比对丝素/丝胶多孔支架生物降解行为的影响。实验结果表明,随着支架中丝胶占比的增多,支架的生物降解速度显著加快,生物降解优先发生于无定形区域。这为用调节支架中丝胶占比的手段,达到调控丝素/丝胶支架的生物降解速度的目的提供了可能性。再次,将人脐静脉血管内皮细胞HUVEC分别接种于丝素/丝胶共混比不同的多孔支架内,进行体外细胞培养,用扫描电子显微镜及激光共聚焦显微镜进行观察和分析,用CCK-8进行细胞活力测试,研究丝胶占比对接种于丝素/丝胶共混多孔支架内细胞的增殖和生长的影响。实验结果表明,细胞均能够贴附于各组多孔支架孔壁表面并充分伸展,形状呈蝌蚪形,随着丝素/丝胶支架中丝胶占比的增多,支架内细胞数量增多,支架内细胞的增殖速度加快。最后,将巨噬细胞RAW264.7接种于不同质量比丝素/丝胶多孔支架内进行体外培养,用CLSM观察细胞的状态,用逆转录-聚合酶链式反应技术测定丝素/丝胶多孔支架刺激巨噬细胞极化后产生炎症细胞因子的水平。并用鲎试剂盒测定丝素及丝胶多孔支架中细菌内毒素的含量,结果表明,随支架中丝胶占比的增多,细胞的数目有所增多,TNF-α、IL-6、IL-1β和COX-2等四种炎症因子的表达量总体上未出现规律性增多或减少的趋势。表明随着支架中丝胶占比的增多,虽能在一定程度上促进巨噬细胞的粘附和增殖,但总体上未明显促进四种炎症因子的表达。细菌内毒素的检测结果表明,丝胶多孔支架中的细菌内毒素含量显著高于丝素多孔支架,提示这是将丝胶用于植入材料的主要潜在风险。若要将丝胶安全地用作生物材料,则需加强蚕吐丝结茧环境和蚕茧加工、贮存环境的净化管理,避免细菌侵入。本文较系统地研究了丝素/丝胶共混多孔支架中丝胶占比对支架孔结构、力学性能、生物降解速度及细胞生长的影响。得到的主要新结论为:(1)发现丝素/丝胶共混多孔支架的内部新增了大量孔径为32.25~65.98 μm的次级孔,在孔壁上新增了大量粒径为249.38~555.94nm的颗粒状凸起,且随着丝素/丝胶共混支架中丝胶占比的增多,次级孔增多,颗粒状凸起的粒径增大,这些新增的次级孔和颗粒状凸起有利于细胞的粘附、铺展和增殖。(2)研究结果证明,随着丝素/丝胶多孔支架中丝胶占比的增多,支架的生物降解速度显著加快,接种于多孔支架内的人脐静脉血管内皮细胞的增殖活力显著提高。(3)测试结果表明,丝胶多孔支架中细菌内毒素含量显著高于丝素多孔支架,这是用丝胶蛋白调节丝素多孔支架性能的主要潜在不利因素。上述研究结论为用丝胶蛋白调节丝素多孔支架的结构、生物降解速度和进一步提高其生物相容性提供了实验依据,同时也指出了丝胶用于生物医学材料需要克服的主要不利因素。
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