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禽传染性支气管炎病毒(Avian infectious bronchitis virus,IBV)引起鸡的一种急性、高度接触性呼吸道传染病,给全球的养禽业带来重大经济损失。IBV属于冠状病毒科gamma冠状病毒属,其基因组为正单链RNA,编码纤突蛋白(Spike glycoprotein,S)、包膜蛋白(Envelope protein,E)、膜蛋白(Membrane protein,M)、核衣壳蛋白(Nucleocapsid protein,N)4种主要结构蛋白。其中,N蛋白由409个氨基酸组成,是一种高碱性磷酸化蛋白,在病毒RNA复制、蛋白翻译、粒子形成、免疫调控等过程中发挥重要作用。结构上,IBV-N蛋白包含N和C端两个功能域,在它们之间存在一段富含丝氨酸(S)和精氨酸(R)的序列(161-217氨基酸),被称为SR区。据报道,SR区域参与SARS-Co V N蛋白的多聚化,在鼠肝炎病毒(MHV)中与非结构蛋白3互作,但其在IBV复制过程中的作用未明。本研究利用突变和反向遗传学技术,对SR区中精氨酸残基影响IBV复制的作用进行了研究。主要研究结果如下:(1)IBV反向遗传学研究结果显示,整个和部分SR区域的缺失(Δ161-217aa,Δ193-217aa和Δ209-217aa)不能拯救出病毒,说明IBV-SR区为IBV复制所必需。(2)为了研究SR区域精氨酸残基对病毒复制的影响,将精氨酸(R)突变为丙氨酸(A),分别构建了含1、2、4个点突变的突变体,取名为R162A、R164A、R167A、M-2R/A(R178A/R182A)、R-4R/A(R182A/R186A/R188A/R189A)。另外,用SARS-Co V的SR区取代IBV-SR区(161-191氨基酸),构建相应的突变体。通过IBV反向遗传学研究,发现均可获得病毒。结果表明,这些精氨酸残基并非IBV复制所必需,SARS-Co V的SR区可替代IBV-SR区行使其功能。(3)噬斑分析结果显示,r IBV、R162A、R164A、和R167A形成噬斑的平均直径无明显差异,表明SR区域162、164、167精氨酸残基的改变对病毒的致病性不产生明显影响或影响不大。但突变体M-2R/A形成的噬斑直径明显小于r IBV,说明同时突变第178和182位精氨酸残基显著降低了IBV致病性;同时突变R182、R186、R188和R189也影响IBV的致病性。另外,用SARSCo V的SR区取代IBV-SR区导致噬斑变小,表明IBV-N蛋白的SR区域功能相对保守,能够被SARS的SR区域取代。(4)为了探究SR区域精氨酸残基对病毒复制与转录的影响,RT-q PCR检测病毒Vero感染细胞中基因组负链RNA和S蛋白的亚基因组(sgm)RNA的合成量,结果发现,感染20 h之后的细胞中,突变体R-4R/A和M-2R/A的负链RNA合成量分别为r IBV感染的0.49和0.12倍,S蛋白sgm RNA合成量分别为0.44倍和0.07倍,而突变体SARS-SR的负链RNA和S蛋白的sgm RNA合成量分别为r IBV的1.77和1.09倍。这些结果表明,4个位点的精氨酸残基的突变(R182A/R186A/R188A/R189A)和2个位点的精氨酸残基的突变(R178A/R182A)均能导致IBV基因组RNA和sgm RNA的合成量减少,但后者对IBV复制的抑制作用更强;与之相反,用SARS-Co V的SR区31个氨基酸取代IBV-SR区161-191位氨基酸能增加IBV基因组RNA和sgm RNA的合成量,促进IBV的复制。(5)Western blot检测病毒感染不同时间段N和S蛋白的表达量,结果表明,在感染12、16和20小时,突变体R-4R/A感染细胞中的N蛋白的表达量分别为r IBV感染细胞中的0.28、0.48和0.41倍;M-2R/A感染细胞中的N蛋白的表达量分别为r IBV感染细胞中的0.17、0.07和0.24倍;而突变体SARSSR感染细胞中的N蛋白表达量分别为r IBV感染细胞中的7.68、1.95和0.96倍。同样地,Western blot检测病毒S蛋白的表达量,发现在感染16和20小时时,突变体R-4R/A和M-2R/A感染细胞中的S蛋白表达量均减少,但M-2R/A的影响更显著。在感染16时,突变体SARS-SR感染细胞中的S蛋白显著高于r IBV感染细胞中的表达量。这些结果表明,4个位点的精氨酸残基的突变(R182A/R186A/R188A/R189A)和2个位点的精氨酸残基的突变(R178A/R182A)均能导致IBV-N和S蛋白的表达量减少,但后者对IBVN和S蛋白合成的抑制作用更强;与之相反,用SARS-Co V的SR区31个氨基酸取代IBV-SR区161-191位氨基酸能显著增加IBV-N和S蛋白的表达。综上所述,研究结果表明,IBV的SR区域为病毒复制所必需,4个位点的精氨酸残基的突变(R182A/R186A/R188A/R189A)和2个位点的精氨酸残基的突变(R178A/R182A)均能抑制IBV的复制,但后者的抑制作用更强;与之相反,用SARS-Co V的SR区31个氨基酸取代IBV-SR区161-191位氨基酸能显著提升IBV的复制水平,揭示了冠状病毒SR区功能的保守性。