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研究目的:肝细胞性肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是全球主要健康问题,每年约有600,000例新病例被诊断为肝癌。2018年,全球死亡率约为8.2%,在所有癌症死亡率中排名第四。我国每年新发病例数占全球新发病例数的50%以上。患者早期通常无明显症状,就诊时多数已处于晚期阶段,从而错过手术治疗。紫杉醇是从太平洋红豆杉中分离得到的天然产物,对肝癌具有显著的疗效。然而,紫杉醇常引起肝癌细胞内磷酸肌醇-3-激酶/苏氨酸蛋白激酶/哺乳动物雷帕霉素(PI3K/mTOR)途径的异常激活。异常活化的Akt和mTOR通过促进细胞增殖和抗凋亡,从而降低抗肿瘤药的有效性。Dactolisib(BEZ235)是一种双重ATP竞争PI3K和mTOR抑制剂。本课题研究紫杉醇联合BEZ235在体内外对肝癌细胞增殖、迁移、周期与凋亡的影响,并探讨其相关效应的分子机制,为临床提高紫杉醇化疗敏感性提供新思路。研究方法:1.磷酸蛋白微阵列分析检测紫杉醇作用肝癌细胞后活化的相关信号通路。2.MTT测定BEZ235、紫杉醇单药及联合使用时肝癌细胞的增殖能力。3.划痕愈合和Transwell实验评估两药联合对肝癌细胞迁移能力的抑制作用。4.流式细胞术检测细胞周期,评估两药联合对细胞周期分布的影响。5.流式细胞术和荧光显微镜(JC-1染色)检测线粒体膜电位变化,评估两药联合对线粒体凋亡的影响。6.流式细胞术和荧光显微镜(Annexin-V FITC/PI染色)检测两药联合对Caspase依赖性途径活化的影响。7.应用荷瘤鼠进一步验证紫杉醇联合BEZ235对肿瘤生长的抑制作用。8.应用Western blot在HepG2细胞和荷瘤鼠肿瘤组织中评估两药联合对细胞周期,迁移,凋亡和PI3K/mTOR通路相关蛋白分子的表达水平。研究结果:1.CSP100结果显示紫杉醇作用HepG2细胞24h后,引起细胞内PI3K/mTOR通路异常活化。WB结果同样证实紫杉醇应激性活化HepG2细胞内PI3K/mTOR通路。2.不同浓度的BEZ235作用HepG2细胞24 h,有效抑制PI3K/mTOR通路的活化并诱导凋亡;3.紫杉醇与不同浓度的BEZ235联合进一步抑制抑制PI3K/mTOR通路的活化,促进细胞凋亡;4.与任一单药组相比,两药联合对细胞增殖的抑制效果更为显著,呈时间浓度双依赖性;与紫杉醇和BEZ235单药相比,两药联合的不同浓度均可抑制HepG2细胞克隆形成;5.紫杉醇在24 h和48 h的迁移抑制率分别为66.5%和49.8%;BEZ235在24 h和48 h的迁移抑制率分别为77.2%和65%。两药联合更进一步抑制细胞的迁移(24h:96.1%,48 h:93.6%);Transwell实验结果显示,紫杉醇和BEZ235单药对细胞迁移的抑制率分别是38.8%和40.0%,两药联合的抑制率则达到70.9%。6.与紫杉醇(16.18%)和BEZ235(6.13%)单药相比,紫杉醇联合BEZ235(33.39%)明显阻滞细胞周期于G2/M期,并能下调调控细胞G2/M期进展的CyclinB1和pCDK1的表达水平。7.JC-1和Annexin V/PI染色结果均显示,紫杉醇联合BEZ235的凋亡率显著高于对照组,紫杉醇组和BEZ235组。流式进一步证明,紫杉醇联合BEZ235的绿红荧光强度比(0.33%)同样高于对照组(0.09%),紫杉醇组(0.15%)和BEZ235组(0.04%);两药联合的凋亡率为29.90%,高于对照组(3.56%),紫杉醇组(7.62%)和BEZ235组(7.19%)。此外,紫杉醇和BEZ235联合使用可显著降低线粒体膜电位,上调线粒体促凋亡相关分子表达水平,增加Caspase9/3/7及PARP的活性,促进HepG2细胞凋亡。8.紫杉醇与BEZ235联合可显着抑制肿瘤生长且小鼠的体重无显著性变化。两药联合抑制PI3Kp85、Akt、mTOR、eIF4EBP1和S6K的磷酸化水平;提高促凋亡相关分子Bak、CytC、Caspase9和Caspase3的表达水平;降低细胞增殖标志物Ki-67的表达。此外,高表达GPC3分子的HepG2异种移植物瘤组织中GPC3阳性细胞的比例也显著降低。研究结论:BEZ235逆转紫杉醇诱导的PI3K/mTOR通路应激性活化,抑制细胞增殖、迁移,阻滞细胞周期进展,促进细胞凋亡,从而增强HCC对紫杉醇的化疗敏感性。紫杉醇联合BEZ235给HCC的治疗带来潜在益处,是一种有希望的治疗方案。图[19]表[2]参[77]