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目的:1.制作不同硬度的生物相容性丙烯酰胺水凝胶及测试其力学性能;2.探明MRTF-A在不同硬度梯度条件下对骨肉瘤MG63细胞的上皮间质转化现象的影响;3.验证基质硬度通过MRTF-A调控骨肉瘤MG63细胞上皮间质转化的具体信号通路及机制。方法:1.合成不同硬度的聚丙烯酰胺水凝胶,并用Instron万能力学测试仪进行检测确认;通过CCK8法检测水凝胶对细胞增殖的影响;通过光镜和荧光显微镜观察细胞形态变化,确认水凝胶体系的建立和可重复性。2.通过钙黄绿素染色定量细胞圆度的变化,同时使用免疫荧光确认细胞骨架的重塑和MRTF-A的核转位;通过蛋白印迹实验检测不同硬度下MRTF-A及EMT的各蛋白和转录因子的改变,同时在使用MRTF-A抑制剂干预后观察其核转位及各蛋白和转录因子的变化,从而了解MRTF-A在骨肉瘤细胞EMT过程中发挥的作用;使用细胞刮痕实验及蛋白印迹实验确认骨肉瘤EMT现象在不同硬度及抑制剂干预下的变化。3.通过蛋白印迹实验检测基质硬度通过MRTF-A调控EMT现象的信号通路,并验证基质硬度与经典TGF-β/Smad信号通路之间的关系。结果:1.聚丙烯酰胺水凝胶可以通过丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺的不同比例形成不同的硬度梯度,并且对细胞没有毒性作用,适合细胞生长;而不同的基质硬度对细胞形态产生不同效应,硬度越低的细胞圆度值越高。2.基质硬度调节肌动蛋白的聚合和MRTF-A的核转位,并且促进骨肉瘤细胞EMT过程和迁移。此外,抑制剂CCG203971显著阻断了MRTF-A的核积累,并且阻断了EMT过程和迁移效应。3.基质硬度通过激活FAK上调RhoA效应分子ROCK和mDia,前者促使肌动蛋白单体与MRTF-A分离,后者可促使单体聚合形成F-actin,从而使细胞骨架进行重塑。MRTF-A与肌动蛋白单体解聚后,进入细胞核内从而促进EMT进程。基质硬度不激活经典的TGF-β/Smad信号通路。结论:聚丙烯酰胺水凝胶体系可以通过硬度的调节对骨肉瘤细胞的形态产生影响,并且通过细胞骨架的重塑和MRTF-A的核转位对骨肉瘤细胞的EMT过程起到调控作用,该过程可以由MRTF-A的抑制剂CCG203971所抑制,机械力学通路独立对该过程起调控作用。