生物药物(biopharmaceuticals)是一类在生物体或活体细胞中生产的生物活性药物。与传统的小分子药物相比,以单克隆抗体为代表的生物药物具有高亲和性、高靶向特异性和低副作用等优点。近年来,重组型免疫球蛋白日益成为治疗癌症和免疫性疾病等顽固性病症的重要药物。与其他分泌型蛋白一样,分泌型重组免疫球蛋白同样具有一条由内质网(ER)经高尔基体(Golgi)最终输送至胞外的分泌途径。期间多种因子参与介导了免疫球蛋白的糖基化修饰、空间折叠、结构重组及转运等多个步骤。本研究旨在构建一个可监控重组型抗体表达和分泌的哺乳动物细胞表达系统,基于这一系统运用基因诱捕技术(gene-trapping)筛选参与抗体表达、分泌相关的因子。人源抗鸡蛋清溶菌酶抗体(HyHEL10)是一种晶体结构已知且表征良好的抗体,以鸡蛋清溶菌酶(HEL)作为相应抗原。本研究采用HyHEL10作为模式抗体在HEK293细胞株和人源单倍体HAP1细胞株中表达。实验将增强型绿色荧光蛋白单体(mEGFP)和FLAG标签融合在抗体重链N端,设计构建出E-F-HyHEL10分泌型重组抗体,以便监控抗体的表达和分泌情况。研究中通过流式细胞分析术检测EGFP的荧光信号可以监控HEK293 E-F-HyHEL10细胞内抗体的表达情况,利用免疫印迹法(Western blotting)和酶联免疫吸附测定(ELISA)可以检测分泌至胞外的抗体水平。流式细胞分析法可以灵敏地检测到布雷菲德菌素A(BFA)作为蛋白质分泌运输抑制剂处理后胞内抗体累积量的明显提升,BFA处理后抗体胞内累积量最高水平可达对照组的1.6倍。放线菌酮(CHX)作为有效的蛋白合成抑制剂抑制了抗体的合成,流式分析和ELISA可以检测到重组抗体表达分泌水平的改变。CHX处理后抗体的胞内累积量急剧下降至对照组的0.5倍。在HAP1人源单倍体细胞株中构建同样的抗体表达系统,用于基因组筛选。将基因诱捕载体整合入HAP1E-F-HyHEL10表达细胞株的基因组,利用piggyBac基因诱捕转座子进行随机突变,通过筛选富集具有高抗体表达水平的PB突变株。利用重组翻转酶(recombinase flippase,FLpe)进一步在分离得到的PB突变单克隆中构建FLPe回复突变细胞株。利用流式细胞分析术和ELISA对PB C4、PB C11、PB C13三株突变单克隆及相应的回复突变株进行表型分析发现,突变株中抗体的表达和分泌均有明显提升,回复突变后抗体表达、分泌可恢复至初始细胞株水平。基因测序分析PB C4、PB C11和PB C13回复突变株中的piggyBac基因诱捕转座子插入位点,可获得相应的捕获突变基因。本课题在HEK293人源细胞株中成功构建了HEK293 E-F-HyHEL10重组抗体表达、分泌系统。其中的E-F-HyHEL10重组抗体具有良好的生物学活性。此抗体表达细胞可以对蛋白质分泌及合成抑制剂的处理有灵敏的反应。重组抗体中融合的EGPF荧光蛋白标签可以实现抗体分泌、表达情况的良好检测。充分利用HAP1细胞株的单倍体基因组优势,基因诱捕获得突变单克隆细胞株均提升了抗体表达水平,相应的突变基因均有可能是与抗体表达、分泌相关的因子。