补体(complement)系统作为天然免疫(innate immunity)中的一类重要和保守的体系,当病原微生物或炎症介质存在时可被激活最终通过末端成分组装成C5b-9膜攻击复合物(membrane attack complex,MAC),为机体提供了快速和高效的清除入侵微生物的途径。MAC是一种多效免疫因子,在补体大量活化后,可插入细胞膜导致细胞溶破死亡,而近年来通过对MAC与有核细胞相互作用的研究,这一观点已发生改变。实验证明:有核细胞能通过囊泡化或内吞作用,清除沉积于细胞膜上的MAC,保护自身免遭补体溶破,此时的MAC称为亚溶破MAC ( sublytic MAC, sMAC )。体外的研究也证实,亚溶破剂量的MAC对多种有核细胞具有刺激和活化作用。近来新的研究发现,非致死剂量的MAC可沉积于中性粒细胞,单核细胞等多种有核细胞,刺激细胞发生多种代谢改变,包括分泌氧自由基、类脂质等炎症介质,并诱导细胞因子、黏附分子以及其他功能蛋白的表达等。补体系统除了补体的直接杀伤机制外,在补体活化过程中释放的多种小片断分子具有广泛的生物学效应,包括趋化中性粒细胞和淋巴细胞、调理吞噬、参与调节细胞和体液免疫应答等等。因此,补体是连接机体天然免疫和获得性免疫(adaptive immunity)的“桥梁”。树突状细胞(dendritic cell,DC)是体内功能最强的专职抗原递呈细胞(antigen-presenting cells,APC),能高效的摄取、加工处理和提呈抗原,具有较强的迁移能力,并能显著地激活初始型T细胞以启动T细胞免疫应答反应,在免疫应答中处于中心调控地位。此外,DC与B细胞以及NK细胞等也存在着相互作用,可见,DC在连接天然免疫和获得性免疫之间起着非常重要的作用。DC是一类异质性的细胞群体,不同的亚群,不同的成熟状态,其免疫学功能特点不同,在免疫应答与免疫耐受、抗肿瘤、抗感染免疫中发挥不同的作用。多种外源或内源因素均可调节DC的分化发育,刺激其成熟以及免疫学功能。但到目前为止,还未见补体攻膜复合物C5b-9与树突状细胞相互作用,特别是补体C5b-9是否影响树突状细胞分化发育成熟已经免疫学功能的相关报道。有研究显示,血液中树突状细胞表面有补体攻膜复合物C5b-9沉积,甚至在培养几天后还能检测到,且树突状细胞的活力也未受影响,在人的滤泡树突状细胞所处的淋巴细胞生发中心也发现了补体攻膜复合物。既然补体和DC均能够连接天然免疫和获得性免疫,且在DC的表面又有C5b-9的沉积,因此我们推测,补体有可能通过调节DC分化发育成熟以及免疫学功能调节机体的免疫应答。为证实这一设想,我们设计并进行了本研究。本研究的完成有助于在免疫应答的调控机制方面获得新的认识,并对补体和DC之间在连接天然免疫和获得性免疫之间的作用及相互关系能有更全面的了解,为进一步从新的角度和思路深入研究DC在抗原特异性免疫应答与免疫耐受中的作用及机制奠定基础。为明确亚溶破C5b-9(sublytic C5b-9, sC5b-9)对树突状细胞分化发育影响,本研究共分三部分:第一部分,外周血单核来源树突状细胞的诱导。选取38例健康志愿者外周血白膜,Ficoll密度梯度离心获得外周血单个核细胞( peripheral blood mononuclear cell,PBMC),贴壁法分离纯化获得较纯的单核细胞(monocyte),在GM-CSF(50ng/ml)和IL-4(25ng/ml)联合作用下诱导分化为未成熟树突状细胞(immaure dendritic cell, imDC),于诱导的第5d,通过镜下观察细胞形态以及流式检测表面标志,结果显示,贴壁后CD14+单核细胞百分率达87%以上,rhGM-CSF+rhIL-4诱导后,细胞CD1a表达上调,CD14表达下降,说明诱导所获细胞未典型imDC,建立了稳定的体外DC培养体系。第二部分,建立体外DC亚溶破模型。利用C5b6、C7、C8、C9补体蛋白纯品,imDC膜表面组装C5b-9,观察细胞的状态,激光共聚焦检测C5b-9在imDC膜上的组装情况,流式检测组装C5b-9后DC的凋亡情况,LDH释放检测C5b-9对DC的溶破效应。结果显示,C5b-9在imDC膜上组装成功,当C5b6浓度小于0.8μg/ml时,C5b-9对DC膜的完整性没有影响,但当大于0.8μg/ml时,膜完整性随着C5b6浓度的增加破坏加剧,因此确定了C5b-9对DC的体外亚溶破剂量为用小于0.8μg/ml C5b6,10μg/ml C7,10μg/ml C8,10μg/ml C9组装的C5b-9,成功建立体外DC亚溶破模型。第三部分,sC5b-9对imDC成熟以及免疫学功能的影响。imDC膜上组装sC5b-9,刺激3d后,流式检测细胞表面的成熟分化标志,HLA相关抗原以及共刺激分子的表达;流式分析抗原捕获能力以及抗原捕获相关分子;ELISA检测sC5b-9处理DC细胞因子分泌情况;与同种异体CD4~+T、CD8~+T或CD4~+CD45RA~+T细胞共培养,通过流式分析DC刺激的CD4+T、CD8~+T等表面活化标志、ELISA检测CD4~+T、CD8~+T或CD4~+CD45RA~+T细胞因子分泌情况,明确DC激活T细胞的能力。在各个实验时LPS(1μg/ml)、C5b-8,C5b-7,C5b6,C7,C8,C9同时用于实验。结果显示:与未刺激组相比,sC5b-9处理DC表面分化标志CD14及CD1a变化不显著,成熟标志CD83、HLA相关抗原、共刺激分子CD80、CD86、B7-H1、B7-H3、B7-H4、BTLA等表达上调;sC5b-9处理DC分泌IL-12及TNF-α上调,抗原捕获能力及抗原捕获相关分子降低;sC5b-9处理DC刺激CD4~+T活化及分泌IFN-γ、IL-2能力增强,IL-10变化不显著,但sC5b-9处理DC刺激CD8~+T活化及分泌IFN-γ、IL-2、IL-10均不显著;sC5b-9处理DC与CD4~+CD45RA~+T共培养后检测细胞因子分泌,发现CD4~+CD45RA~+T分泌IL-4降低而IFN-γ增加。以上结果表明,sC5b-9促进的DC成熟,诱导了Th1极化。通过以上三部分的研究,我们得出如下结论:直接贴壁法能获得相对较纯的单核细胞,利用rhGM-CSF联合rhIL-4贴壁的单核细胞,隔日半量补充细胞因子,在第5d能获得典型的imDC。利用补体蛋白纯品C5b6、C7、C8、C9在合适条件下能体外于imDC膜表面组装C5b-9,当补体纯品C5b6浓度小于0.8ug/mL时,组装的C5b-9为亚溶破型。sC5b-9能促进imDC向成熟DC转变,同时抗原捕获能力降低,IL-12和TNF-α分泌上调;sC5b-9处理DC同种异体混合淋巴细胞反应能力增加,激活CD4~+T细胞能力提高并诱导初始T细胞Th1极化。综上所述,作为天然免疫重要组成部分的补体系统,除了能够直接杀伤入侵的病原微生物外,还可以通过在活化形成的攻膜复合物C5b-9调控机体内最重要的抗原提呈细胞—DC的成熟以及免疫学功能,从而发挥免疫调控作用。上述研究结果对于深入认识天然免疫和获得性免疫之间的作用以及相互关系,探讨获得性免疫的启动以及维持自身免疫耐受的机制等提供了实验线索。