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纳米氧化铝(Aluminum Oxide Nanoparticles,Al2O3-NPs)是生产最多应用广泛的纳米材料,大量Al2O3-NPs进入空气,被吸入人体内,这需要重新评价经鼻Al2O3-NPs暴露的毒性,特别是孕期Al2O3-NPs经鼻暴露引起的毒性危害。首先,我们建立孕期Al2O3-NPs经鼻暴露SD大鼠和C57BL/6小鼠模型,孕鼠随机分为3 组(ddH2O,Al2O3-NPs,AlCl3(0.7mg Al/kg和 1.4mg Al/kg)),整个孕期每天鼻腔滴注直至子鼠出生停止染毒。分别在子代SD大鼠Pl、P21天处死并收集脏器,利用ICP-MS分析检测子鼠血清、P1、P21脏器中总铝含量;SD大鼠海马区 real-time PCR、Western Blot 检测突触相关(NR2B、PSD-95、SNAP25)mRNA、蛋白表达水平:P21 SD大鼠经心脏灌注固定后,分离海马CA1区制备TEM样本,观测CA1区突触结构变化。C57BL/6小鼠P35进行学习记忆实验(跳台实验、避暗实验、水迷宫实验),完成后处死并收集脏器,Western Blot分析突触相关蛋白(NR2B、PSD-95、SNAP25)表达水平。ICP-MS分析检测SD大鼠血清中总铝含量发现,P1 SD大鼠血清中Al203-NPs组血清总铝含量显著高于对照组、AlCl3组。而P21 SD大鼠血清,各组间无显著性差异。P1 SD大鼠肝、肺、脾、肾、脑,Al203-NPs组脏器总铝含量均显著高于对照组、AlCl3组。P21 SD大鼠肝、肺、脾、肾、下丘脑、海马区、大脑皮层,Al2O3-NPs组脏器总铝含量均显著高于对照组、AlCl3组。real-time PCR结果显示,子代SD大鼠海马区突触相关基因NR2B、PSD-95、SNAP25的表达水平在各组间无显著性差异。子代SD大鼠海马区突触相关蛋白NR2B、PSD-95的表达水平在各组间存在显著性差异,而SNAP25表达水平未出现显著。分析TEM照片发现,各组间突触计数、突触后致密物厚度均存在显著性差异,而突触活性区长度各组间无显著性差异。C57BL/6小鼠行为学结果显示,各组间小鼠错误次数未出现显著性差异。C57BL/6小鼠海马区突触相关蛋白NR2B、PSD-95的表达水平在各组间存在显著性差异,而SNAP25表达水平未出现显著。因此我们认为孕期Al203-NPs经鼻暴露可改变子代海马CA1区突触微结构,引起海马区NR2B/PSD-95蛋白表达水平改变,但并未导致子代出现行为学改变。第一部分孕期纳米氧化铝经鼻暴露引起子代海马区铝蓄积目的采用孕期SD大鼠模型鼻腔滴注纳米氧化铝,观察子代铝蓄积情况。方法分别运用TEM和DLS法对纳米氧化铝进行表征实验。雌雄SD大鼠各21只,交配怀孕后孕鼠单独饲养,随机分为3组(ddH2O,Al2O3-NPs,AlCl3(0.7mg Al/kg体重)),整个孕期每天鼻腔滴注直至子鼠出生。分别在子代P1、P21天处死并收集脏器,利用ICP-MS分析检测子鼠血清、P1、P21脏器中总铝含量。结果通过TEM和纳米粒径及电位分析仪对Al203-NPs大小进行表征,TEM结果显示,Al2O3-NPs分散均匀,平均粒径为36.7±12.4nm。动态光散色法结果显示,Al2O3-NPs在超纯水中有轻微的团聚,水合粒径为70.1±32.5nm。ICP-MS分析检测子代血清中总铝含量发现,P1子鼠血清中Al2O3-NPs组血清总铝含量显著高于对照组、AlCl3(P<0.001,P<0.01)。而P21子鼠血清,各组间无显著性差异。P1子鼠肝、肺、脾、肾、脑,Al2O3-NPs组脏器总铝含量均显著高于对照组、AlCl3组(all P<0.001)。P21子鼠肝、肺、脾、肾、下丘脑、海马区、大脑皮层,Al2O3-NPs组脏器总铝含量均显著高于对照组、AlCl3组(all P<0.001)。具体如下,Al2O3-NPs组肝、肺、脾、肾脏中总铝含量显著高于对照组、AlCl3组(all P<0.001);Al2O3-NPs、AlCl3组下丘脑总铝含量显著高于对照组(P<0.001,P<0.01);Al2O3-NPs、AlCl3组海马区总铝含量显著高于对照组(P<0.001,P<0.01),Al2O3-NPs组总铝含量高于AlCl3组(P<0.05);Al2O3-NPs组大脑皮层中总铝含量显著高于对照组、AlCl3组(both P<0.001)。结论孕期Al2O3-NPs经鼻暴露后,子代血清及各脏器中出现铝蓄积,尤其是在大脑中出现蓄积。第二部分 孕期纳米氧化铝经鼻暴露引起子代海马CA1区突触结构改变目的由于孕期纳米氧化铝暴露后出现子代大脑铝蓄积,为研究对子代突触可塑性影响,观察分析海马CA1区突触结构改变及突触相关基因蛋白改变。方法(1)子鼠海马区总RNA提取,real-time PCR检测突触相关基因mRNA表达水平;(2)子鼠海马区蛋白质提取,Western Blot分析突触相关蛋白表达水平;(3)P21子鼠采用心脏灌注固定后,TEM观测CA1区突触结构变化。结果real-time PCR显示,子代大脑海马区突触NR2B、PSD-95、SNAP25的mRNA表达水平在各组间无显著性差异。子代大脑海马区突触相关蛋白NR2B、PSD-95的表达水平在各组间存在显著性差异,而SNAP25表达水平未出现差异。灰度分析显示,Al2O3-NPs和AlCl3组PSD-95蛋白表达显著高于对照组(both P<0.001),Al2O3-NPs和AlC13间无显著性差异;Al2O3-NPs组NR2B蛋白表达显著高于AlCl3和对照组(both P<0.001),AlCl3和对照组间无显著性差异。统计分析TEM照片,各组间突触计数、突触后致密物厚度均存在显著性差异,而突触活性区长度各组间无显著性差异。如下,Al2O3-NPs和AlCl3组突触计数显著高于对照组(P<0.05,P<0.001),AlC13组突触计数显著高于Al2O3-NPs组(P<0.05);Al2O3-NPs和AlCl3组突触后致密物厚度显著小于对照组(P<0.01,P<0.001)。结论孕期SD大鼠Al2O3-NPs经鼻暴露引起的海马区铝蓄积,造成了子代海马区突触相关蛋白(NR2B/PSD-95)表达改变,海马CA1区突触结构改变,这都可能导致子代神经发育损伤。第三部分孕期纳米氧化铝经鼻暴露对子代学习记忆行为的影响目的为研究孕期Al2O3-NPs经鼻暴露引起的子代海马CA1区突触微结构改变,是否导致子代学习记忆行为的改变。方法雌雄C57BL/6小鼠各30只,交配怀孕后孕鼠单独饲养,随机分为3组(ddH20,Al2O3-NPs,AlCl3(1.4mg Al/kg体重)),整个孕期每天鼻腔滴注直至子鼠出生停止染毒。子鼠P35进行学习记忆实验(跳台实验、避暗实验、水迷宫实验),完成后处死并收集脏器,Western Blot分析突触相关蛋白(NR2B、PSD-95、SNAP25)表达水平。结果C57BL/6小鼠行为学结果显示,各组间小鼠错误次数未出现显著性差异。子代大脑海马区关键蛋白NR2B、PSD-95的表达水平在各组间存在显著性差异,而SNAP25表达水平未出现显著。灰度分析结果显示,Al203-NPs组NR2B蛋白表达显著高于AlCl3和对照组(P<0.001,P<0.05),对照组NR2B蛋白表达显著高于AlCl3组(P<0.001);AlCl3组PSD-95蛋白表达显著高于对照组、Al2O3-NPs组(both P<0.001),Al2O3-NPs和对照组间无显著性差异。结论孕期Al2O3-NPs经鼻暴露可改变子代海马CA1区突触微结构,海马区NR2B/PSD-95蛋白表达水平改变,但并未引起子代出现学习记忆行为损伤。