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普通变形杆菌（Proteus vulgaris）为环境和临床中常见的条件致病菌,在特定条件下会引起胃肠感染、尿路交叉感染等疾病。环丙沙星等抗生素广泛用于治疗该类细菌所引发的感染,但也使得耐药细菌大量出现,严重影响临床治疗效果,危及人类生命健康。本实验室前期从南美白对虾肠道中分离得到一株携带有两个内源质粒的变形杆菌（Proteus）,后经本研究鉴定为普通变形杆菌。本研究将该普通变形杆菌命名为P3M并将其作为研究对象,通过全基因组测序（Wholegenome sequencing,WGS）和一系列实验对其进行全面鉴定,明确了其作为多重耐药菌的环丙沙星和多粘菌素抗性机制。具体研究内容如下:1.通过全基因组测序对P3M基因组进行鉴定,得到包括编码基因数量及功能、GC含量、非编码RNA（non-coding RNAs,nc RNAs）、重复序列等详细信息。依据COG数据库和KEGG数据库分析将所得到的全部功能基因划分为22个功能类群以及六大类代谢通路。分析发现P3M基因组上存在分属于36个抗生素大类的218个抗生素抗性基因（antibiotic resistance genes,ARGs）,同时最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration,MIC）测定实验表明P3M对16种常见抗生素呈现出明显抗性,表明该菌为一株食源性多重耐药细菌。棋盘法MIC测定实验表明,四环素和环丙沙星抗生素联合使用时能够显著抑制P3M生长,发挥协同杀菌效果。进一步的生物信息学分析表明,P3M基因组上存在Bae S-Bae R和Cpx A-Cpx R两类可介导菌株多重耐药性的双组分系统（two-component systems,TCSs）,以及包括质粒、位点特异性重组酶、正向重复序列在内的多类可移动遗传元件（mobile genetic elements,MGEs）。本研究明确了食源性多重耐药普通变形杆菌P3M的基因组特性及耐药特点,将为深入了解环境中普通变形杆菌的抗性传播和转移规律奠定基础。2.P3M中存在两个内源质粒p3M-2A和p3M-2B,大小分别为2,656 bp和5,903 bp。p3M-2B携带一个喹诺酮抗性基因qnr D,而p3M-2A不携带抗性基因。qnr D携带质粒按照其大小可分为2.7 kb和4.3 kb两大类,但p3M-2B不满足该规律。质粒消除及qRT-PCR实验表明,p3M-2A质粒对于p3M-2B质粒上qnr D的表达具有明显的促进作用,其中ORF1起到主要的调控功能。质粒线性比对分析表明,p3M-2B上的ORF1-4为qnr D携带质粒发挥功能所必需的最保守序列,而ORF5则为通过正向重复序列DR-C同源重组而在长期进化过程中所获得的外源DNA序列。本研究提出了较大型qnr D携带质粒的形成过程模型,为抗生素抗性基因水平转移研究提供了新的思路。3.本研究在环丙沙星处理条件下鉴定得到了一个参与P3M菌株环丙沙星抗性调控的非编码RNA Csi R（ciprofloxacin stress-induced nc RNA）。生存率实验表明,Csi R缺失突变菌株的存活率相较于野生型P3M明显提升,说明该非编码RNA发挥负调控功能。通过进一步的靶标基因预测、qRT-PCR、微量热泳动（microscale thermophoresis,MST）等实验,我们鉴定得到了Csi R参与环丙沙星抗性调控的靶标基因emr B,并证明了Csi R通过与emr B m RNA 5’UTR区域互作影响了emr B的翻译过程。此外,通过序列比对我们发现Csi R与emr B m RNA的互作位点在其他已测序的普通变形杆菌中高度保守,暗示这种调控机制可能普遍存在于该种细菌中。本研究揭示了非编码RNA Csi R在普通变形杆菌环丙沙星抗性调控过程中的重要作用,为今后明确普通变形杆菌多重耐药性的产生机制提供理论基础。4.本研究通过全基因组测序和qRT-PCR鉴定得到了一个能够特异响应多粘菌素压力信号的非编码RNA Psi R（polymyxin B stress-induced nc RNA）,其突变菌株Δpsi R在多粘菌素处理条件下的生存率显著低于野生型P3M,说明该非编码RNA参与到了菌株的多粘菌素抗性调控过程中。之后通过靶标基因预测、qRTPCR、MST等实验我们鉴定得到了Psi R参与P3M菌株多粘菌素抗性调控的靶标基因pgs A,并通过半衰期测定等实验明确了Psi R通过与pgs A m RNA结合打开了位于后者作用位点前端的茎环结构,从而在转录后水平提高了pgs A m RNA的稳定性,增强了菌株的多粘菌素抗性。本研究揭示了非编码RNA Psi R在P3M菌株耐药性调控过程中的重要角色及其在普通变形杆菌进化中的高度保守性,为今后进一步明确普通变形杆菌多粘菌素耐药性的产生机制奠定基础。综上,本研究揭示了普通变形杆菌P3M的多重耐药特性及其进化特点,并系统鉴定了参与P3M环丙沙星和多粘菌素抗性调控的质粒及非编码RNA,明确了其参与各抗性调控过程的作用机制及对于研究同种属内其他细菌耐药性产生和传播的重要指导意义,为今后相关领域的研究奠定基础。