肠缺血再灌注（ischemia/reperfusion,I/R）损伤作为一种外科常见的病理生理过程,除原发于肠道及肠系膜血管本身病变,同时也可继发于多种重症疾病的病程中,如失血性休克、大面积烧伤等,具有较高的临床发病率和病死率。肠I/R损伤不仅导致肠道局部损伤和破坏,而且其对全身病理生理状态的影响远大于局部损伤。目前认为肠I/R损伤所致肠黏膜屏障功能受损,可导致肠道通透性增加及肠腔内定植菌群移位。同时在多种病理性刺激因子的共同作用下,肠I/R损伤最终可引发全身炎症反应综合征（systemic inflammatory response syndrome,SIRS）及多器官功能障碍综合征（multiple organ dysfunction syndrome,MODS）,严重影响病人预后。因此,研究肠I/R损伤的发病机制,并针对性给予及时的、有效的干预对减轻疾病损伤具有重要意义。维护肠黏膜屏障结构和功能的完整是防止肠I/R后肠屏障损伤及继发MODS的关键。肠黏膜上皮细胞（intestinal epithelial cells,IECs）是黏膜屏障的重要结构基础。既往研究认为I/R引起的凋亡、坏死性凋亡等细胞死亡均可造成IECs大量损失,破坏肠黏膜屏障完整性。随着对细胞死亡形式的深入研究,非凋亡性程序性细胞死亡（regulated cell death,RCD）,如焦亡、铁死亡等被逐渐认知并发现其参与多种疾病的发生发展过程。因此,研究肠I/R中此类细胞死亡的作用及其发生机制,可以为防治原位脏器及远隔脏器损伤提供新的思路和策略。Dixon等于2012年首次发现并报道了一种新的死亡形式---铁死亡。铁死亡是一种铁离子依赖的、以脂质过氧化物蓄积为主要特点的细胞死亡,其在形态、生化、免疫等方面具备不同于凋亡、坏死性凋亡、自噬性细胞死亡等的特点。目前研究表明,铁死亡与神经退行性疾病、肿瘤、肝纤维化等密切相关。目前已有报道证实,铁死亡是导致心、肝、肾等器官I/R损伤的重要原因,抑制铁死亡可减少细胞死亡,减轻I/R损伤,同时前期实验结果显示,肠I/R早期小肠组织内出现明显的铁死亡变化,提示铁死亡可能是参与肠I/R损伤的重要原因,但其调控机制尚未有研究。长链脂酰辅酶A合成酶4（acyl-Co A synthetase long-chain family member 4,ACSL4）是ACSLs家族中的一员。区别于家族其他成员,ACSL4的特点在于其可催化花生四烯酸（arachidonic acid,AA）合成为花生四烯酰辅酶A,进而参与合成磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine,PE）。PE是细胞膜磷脂的主要成分,也是铁死亡中发生脂质过氧化反应的重要成分。Doll等研究证实,敲除ACSL4可显著抑制AA转化为PE,进而降低细胞对铁死亡的易感性,防止铁死亡的发生。因此,抑制ACSL4为治疗铁死亡相关疾病提供了新的可行方案。我们前期实验结果显示,肠缺血后组织内ACSL4蛋白表达及m RNA水平升高,提示ACSL4可能参与调控缺血后肠组织对铁死亡的敏感性。Special protein1（SP1）是最早被发现和克隆的转录因子,其可特异性与下游靶基因启动子区GC盒结合,从而促进靶基因的转录和表达。有研究证实,缺氧可上调核内SP1的表达,从而导致细胞死亡。通过数据库预测,ACSL4基因启动子区富含GC盒,存在SP1的调控位点。因此,缺血时ACSL4高表达可能是受SP1调控的。综上所述,我们提出本课题假说如下:铁死亡是导致肠I/R损伤的重要机制;缺血肠组织中ACSL4高表达是再灌注后发生铁死亡的重要原因;ACSL4过量表达可能是受SP1在转录水平的调控。为证明该假说,本研究通过以下三部分进行论述:第一部分:铁死亡是引起肠I/R损伤的重要机制;第二部分:抑制ACSL4可减轻铁死亡,改善肠I/R再灌注损伤;第三部分:SP1可结合于ACSL4基因启动子区,调控ACSL4表达。本研究将肠I/R损伤的发生提供重要的、新的机制和靶点。早期给予有效措施,干预铁死亡及相关调控因子是防治肠I/R引起的原位脏器损伤,避免发生SIRS和MODS的重要环节,对改善临床重症患者预后具有重要意义。第一部分铁死亡是引起肠I/R损伤的重要机制背景:肠上皮细胞的大量死亡是肠I/R损伤的重要原因。既往研究中证实,心、肝、肾等脏器在I/R后细胞发生铁死亡,导致组织严重损伤;给予铁死亡抑制剂可以显著减轻I/R后组织损伤。肠I/R中是否也会发生铁死亡,以及抑制铁死亡对小肠及远隔脏器损伤影响如何?目的:探讨肠I/R后是否发生铁死亡,阐明抑制铁死亡对肠I/R后肠道及远隔脏器损伤的影响。方法:实验1.C57BL/6小鼠构建肠单纯缺血及肠I/R模型,假手术组（sham）只开腹分离血管不进行夹闭。单纯缺血组采用夹闭肠系膜上动脉法缺血30、45及60min;I/R组在夹闭肠系膜上动脉,造成缺血45min后移去动脉夹,再灌注15、30、60、120、240min。各组在单纯缺血或缺血再灌注后取小肠组织,通过western blot、脂质过氧化检测、电镜等方法检测铁死亡相关指标。实验2.C57BL/6小鼠建立I/R模型。小鼠术前1h腹腔注射铁死亡特异性抑制剂liproxstatin-1（10 mg/kg）作为处理因素,分为四组:正常组（sham）、正常+抑制剂组（sham+lip）、模型组（I/R）和模型+抑制剂组（I/R+lip）。各组在再灌注后取材进行后续检测:HE染色观察小肠、肝、肺组织病理变化;western blot检测铁死亡相关蛋白表达;血清LDH、FD-4、TNF-α、IL-6水平检测肠屏障损伤和炎性介质释放;LPO、12/15-HETE检测脂质过氧化水平;肝肺MPO、肺干湿比检测远隔脏器损伤。实验3.Caco-2细胞构建H/R损伤模型。细胞造模前12h加入liproxstatin-1（200n M）作为处理因素,分为四组:正常组（control）、正常+抑制剂组（control+lip）、模型组（H/R）和模型+抑制剂组（H/R+lip）。各组在复氧后取材进行后续检测:western blot检测铁死亡相关蛋白表达;CCK-8、TEER、LDH检测细胞及屏障功能损伤;BODIPY 581/591 C11绿色荧光染料、LPO、12/15-HETE检测脂质过氧化水平。结果:实验1.与sham组相比,缺血45min的小肠组织内,促铁死亡因子ACSL4、iron升高,抑制铁死亡因子GPx4、FTH1、GSH下调;再灌注30min的小肠组织内,细胞结构出现更明显的铁死亡特征,GPx4表达下调,COX2表达和脂质过氧化指标12/15-HETE升高。实验2.与sham组相比,I/R组小肠组织内GPx4表达量明显下降,COX2表达明显升高,小肠病理学损伤明显,血清中FD-4、LDH、TNF-α、IL-6含量升高,12/15-HETE、LPO水平升高,远隔脏器肝、肺病理学损伤明显,肺湿干比值增加,MPO含量升高;与I/R组相比,I/R+lip组小肠组织内GPx4表达量明显升高,COX2表达明显下降;小肠病理损伤明显改善,血清中FD-4、LDH、TNF-α、IL-6含量降低,12/15-HETE、LPO水平降低;远隔脏器病理损伤减轻,肺湿干比值降低,MPO含量减小。实验3.与control组相比,H/R组Caco-2细胞GPx4表达量明显减少,COX2表达明显增加;细胞生存率明显降低,屏障功能减弱;BODIPY C11绿色荧光增强,12/15-HETE、LPO水平升高,培养基中LDH含量增加;与H/R组相比,H/R+lip组Caco-2细胞GPx4表达量明显增多,COX2表达明显减少;细胞生存率明显升高,屏障功能增强;BODIPY C11绿色荧光减弱,12/15-HETE、LPO水平降低,培养基中LDH含量减少。结论:1.肠缺血再灌注早期会发生铁死亡。2.抑制铁死亡可减轻肠缺血再灌注后小肠及远隔脏器损伤,改善肠道屏障功能,减少脂质过氧化。第二部分抑制ACSL4可减轻铁死亡引起的肠I/R损伤背景:前述实验显示,肠I/R早期会发生铁死亡。抑制铁死亡可减轻肠I/R后小肠及远隔脏器损伤,改善肠道屏障功能,减少脂质过氧化。但如何减轻缺血再灌注后铁死亡?其关键靶点是什么?目的:验证肠缺血后ACSL4表达变化,证实抑制ACSL4对减轻铁死亡、改善肠I/R损伤的作用。方法:实验1.选取3例经手术证实的绞窄性肠梗阻病例,术中切取缺血肠管1cm作为样本,另取切除肠段侧缘正常组织作为对照（研究方案经大连医科大学附属第二医院伦理委员会审核批准）,各肠管标本收集黏膜组织提取蛋白,采用western blot法检测ACSL4的蛋白表达水平。实验2.C57BL/6小鼠建立单纯缺血（Ischemia）模型。小鼠术前1h静脉注射罗格列酮（rosiglitazone,ROSI,0.4 mg/kg）作为处理因素抑制ACSL4,分为四组:正常组（sham）、正常+抑制剂组（sham+ROSI）、模型组（Ischemia）和模型+抑制剂组（Ischemia+ROSI）。各组在缺血后取材进行ACSL4检测。实验3.C57BL/6小鼠建立I/R模型。小鼠术前1h静脉注射罗格列酮（rosiglitazone,ROSI,0.4 mg/kg）作为处理因素抑制ACSL4,分为四组:正常组（sham）、正常+抑制剂组（sham+ROSI）、模型组（I/R）和模型+抑制剂组（I/R+ROSI）。各组在再灌注后取材进行后续检测检测:HE检测小肠组织病理变化,血清FD-4、LDH检测肠屏障功能和损伤,western blot检测铁死亡相关蛋白,5/12/15-HETE、LPO检测脂质过氧化水平。实验4.Caco-2细胞构建H/R损伤模型,以ACSL4 RNA干扰（RNA interference,RNAi）为处理因素,分为四组:正常组+RNAi阴性对照组（control+si-NC）、正常+ACSL4 RNAi组（control+si-ACSL4）、模型组+RNAi阴性对照组（H/R+si-NC）和模型+ACSL4 RNAi组（H/R+si-ACSL4）。各组在复氧后取材进行后续检测:western blot检测铁死亡相关蛋白表达;CCK-8、TEER、LDH检测细胞及屏障功能损伤;BODIPY 581/591 C11绿色荧光染料、5/12/15-HETE、LPO检测脂质过氧化水平。结果:实验1.与normal组相比,人缺血小肠组织内,ACSL4表达升高。实验2.与sham组相比,Ischemia组小肠组织内ACSL4活性明显升高;与Ischemia组相比,Ischemia+ROSI组小肠组织内ACSL4活性明显降低。实验3.与sham组相比,I/R组小肠病理学损伤明显,血清中FD-4含量升高,小肠组织内GPx4表达量明显下降,COX2表达明显升高,5/12/15-HETE、LPO水平升高,血清中LDH含量升高;与I/R组相比,I/R+ROSI组小肠病理损伤明显改善,血清中FD-4含量降低,小肠组织内GPx4表达量明显升高,COX2表达明显下降,5/12/15-HETE、LPO水平降低,血清LDH含量降低。实验4.与control组相比,H/R组Caco-2细胞GPx4表达量明显减少,COX2表达明显增加,细胞生存率明显降低,屏障功能减弱,BODIPY C11绿色荧光增强,5/12/15-HETE、LPO水平升高,培养基中LDH含量增加;与H/R组相比,H/R+si-ACSL4组Caco-2细胞GPx4表达量明显增多,COX2表达明显减少;细胞生存率明显升高,屏障功能增强;BODIPY C11绿色荧光减弱,5/12/15-HETE、LPO水平降低,培养基中LDH含量减少。结论:1.缺血后,小肠组织内ACSL4蛋白表达增加,活性增强。2.再灌注前抑制ACSL4可减轻肠缺血再灌注后小肠损伤,改善肠道屏障功能,抑制铁死亡,减少脂质过氧化。第三部分SP1结合于ACSL4启动子区促进其表达背景:前述结果显示,抑制铁死亡可以明显减轻肠I/R损伤;ACSL4是诱导再灌注后发生铁死亡的重要因子,抑制缺血后ACSL4的激活可减少铁死亡的发生,保护小肠。何种机制参与调控ACSL4蛋白?目的:验证转录因子SP1对ACSL4的调节作用,并进一步证实调控位点。方法:实验1.选取6例经手术证实的绞窄性肠梗阻病例,术中切取缺血肠管1cm作为样本,另取切除肠段侧缘正常组织作为对照（研究方案经大连医科大学附属第二医院伦理委员会审核批准）,各肠管标本收集黏膜组织提取RNA,采用q PCR法检测ACSL4的m RNA表达水平;C57BL/6小鼠建立单纯缺血（Ischemia）模型,收集各组小肠组织提取RNA,采用q PCR法检测ACSL4的m RNA表达水平;Caco-2细胞构建单纯缺氧（hypoxia）模型,收集各组细胞,采用q PCR法检测ACSL4的m RNA表达水平,提取细胞核蛋白检测核内SP1表达,采用细胞免疫荧光法检测SP1细胞核内表达及分布。实验2.Caco-2细胞构建单纯缺氧（hypoxia）模型,以SP1 RNA干扰为处理因素,分为四组:正常组+RNAi阴性对照组（control+si-NC）、正常+SP1 RNAi组（control+si-SP1）、模型组+RNAi阴性对照组（H/R+si-NC）和模型+SP1 RNAi组（H/R+si-SP1）;以SP1过表达质粒（pc DNA）为处理因素,分为四组:正常组+过表达阴性对照组（control+pc DNA-NC）、正常+SP1过表达组（control+pc DNA-SP1）、模型组+过表达阴性对照组（H/R+pc DNA-NC）和模型+SP1过表达组（H/R+pc DNASP1）。各组在缺氧后取材进行检测:western blot检测SP1、ACSL4蛋白表达,q PCR法检测ACSL4的m RNA表达水平。实验3.在Caco-2细胞中,以常氧（control）和缺氧（hypoxia）为条件,以共转染SP1过表达质粒（pc DNA）和双荧光素酶报告基因标记的ACSL4启动子克隆质粒（ACSL4-prom S）为处理因素,各分为四组:常氧（control+pc DNA-NC+ACSL4-vector、control+pc DNA-SP1+ACSL4-vector、control+pc DNA-NC+ACSL4-prom S、control+pc DNA-SP1+ACSL4-prom S）;缺氧（hypoxia+pc DNA-NC+ACSL4-vector、hypoxia+pc DNA-SP1+ACSL4-vector、hypoxia+pc DNA-NC+ACSL4-prom S、hypoxia+pc DNA-SP1+ACSL4-prom S）。各组在处理后取材进行双荧光素酶报告基因检测。实验4.在Caco-2细胞中,以常氧（control）和缺氧（hypoxia）为条件,以SP1为实验组,RNA聚合酶Ⅱ（RNA PolymeraseⅡ）为阳性对照,各分为三组:Input、positive control、SP1。各组在处理后进行Ch IP实验,根据数据库预测,针对三种位点设计引物GL1、GL（2,3）,并通过琼脂糖凝胶电泳筛选有效位点。实验5.在Caco-2细胞中,以常氧（control）和缺氧（hypoxia）为条件,以共转染SP1过表达质粒（pc DNA）和双荧光素酶报告基因标记的ACSL4启动子克隆及特定位点（GL2、GL3）缺失质粒为处理因素,各分为三组:常氧（control+pc DNASP1+WT、control+pc DNA-SP1+Del-GL2、control+pc DNA-SP1+Del-GL3）;缺氧（hypoxia+pc DNA-SP1+WT、hypoxia+pc DNA-SP1+Del-GL2、hypoxia+pc DNASP1+Del-GL3）。各组在处理后取材进行双荧光素酶报告基因检测。结果:实验1.与normal/sham组相比,人和小鼠缺血小肠组织中ACSL4 m RNA水平升高;与control组相比,缺氧细胞中ACSL4 m RNA水平升高,细胞核内SP1蛋白表达及分布增加。实验2.与control+si-NC组相比,control+si-SP1组SP1、ACSL4蛋白表达减少,ACSL4 m RNA水平降低;与hypoxia+si-NC组相比,hypoxia+si-SP1组SP1、ACSL4蛋白表达减少,ACSL4 m RNA水平降低。与control+pc DNA-NC组相比,control+pc DNA-SP1组SP1、ACSL4蛋白表达增加,ACSL4 m RNA水平升高;与hypoxia+pc DNA-NC组相比,hypoxia+pc DNA-SP1组SP1、ACSL4蛋白表达增加,ACSL4 m RNA水平升高。实验3.与control+pc DNA-SP1+ACSL4-vector组相比,control+pc DNASP1+ACSL4-prom S组荧光素报告基因活性增强;与hypoxia+pc DNA-SP1+ACSL4-vector组相比,hypoxia+pc DNA-SP1+ACSL4-prom S组荧光素酶报告基因活性增强。实验4.在常氧及缺氧情况下,与GL1位点相比,GL（2,3）可扩增出明显条带。实验5.在常氧情况下,与control+pc DNA-SP1+WT组相比,control+pc DNASP1+Del-GL2组荧光素酶报告基因活性减弱,而control+pc DNA-SP1+Del-GL3未有明显变化;在缺氧情况下,与hypoxia+pc DNA-SP1+WT组相比,hypoxia+pc DNASP1+Del-GL2组荧光素酶报告基因活性减弱,而hypoxia+pc DNA-SP1+Del-GL3未有明显变化。结论:1.转录因子SP1上调ACSL4转录水平,进而促进其表达。2.转录因子SP1通过结合在ACSL4启动子区GL2位点调控其转录。综上,铁死亡是再灌注早期小肠损伤的重要机制,抑制铁死亡可显著改善小肠及远隔脏器损伤;缺血诱导ACSL4的上调是铁死亡发生的关键原因,抑制ACSL4可明显减少铁死亡,降低脂质过氧化,保护细胞,改善肠屏障功能;转录因子SP1是细胞缺氧后ACSL4转录水平升高、表达增加的重要因子。本研究阐明了肠I/R早期损伤的发生机制,为更有效防治肠I/R损伤提供了潜在的早期干预机制和靶点,对降低降低重症患者致残率和死亡率具有重要意义。