解淀粉芽孢杆菌对鸡白痢沙门菌致茶花鸡肠道损伤的保护作用

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鸡白痢是由鸡白痢沙门氏菌(Salmonella Pullorum)血清型感染引起的一种流行广泛的急性全身性传染病;该病既可通过卵垂直传播也可通过接触以及媒介水平传播,是造成我国养禽业重大经济损失的禽类传染病之一。目前对于鸡白痢的防治主要有两个手段:一是从种鸡入手进行净化,但本方法费时费力,且需要进行世代净化;二是使用抗生素类药物治疗,但随着家禽养殖中抗生素的滥用,细菌耐药性问题也越来越突出,给养殖业生产造成巨大损失,并严重威胁人类健康。因此,迫切需要找到能够有效控制病原体并替代抗生素的策略。作为一种可直接添加到饲料中的微生态制剂,益生菌可对动物生长发育和繁殖等生产性能产生有益影响。其中,芽孢杆菌是研究最多的一类益生菌。然而,解淀粉芽孢杆菌在家禽养殖上拮抗鸡白痢沙门菌的作用探究尚不够全面,对地方优质鸡种的研究尚有缺乏。因此,本文主要围绕解淀粉芽孢杆菌对鸡白痢沙门菌致茶花鸡肠道损伤的保护作用展开研究。为探究解淀粉芽孢杆菌对肠道致病菌的抑菌作用,本研究从10份鸡场环境土壤及5份健康鸡肠道内容物中,分离出5株耐高温芽孢杆菌,通过菌株形态学、革兰氏染色、细菌生化试验、16s r RNA测序和基因进化树分析等鉴定为解淀粉芽孢杆菌。随后采用琼脂打孔法研究其对肠道菌群的体外抑菌作用,结果显示5株芽孢杆菌对肠炎沙门氏菌YN-S1、YN-S2,鸡白痢沙门菌YN-SP9、YN-SP10,大肠杆菌DO157均有抑菌作用,且YN-BA2株抑菌效果最好。然而,要发挥益生作用,需保证解淀粉芽孢杆菌能够在家禽肠道定植,因此对其在胃肠道环境的抗逆性能进行评价是筛选益生菌的重要环节。本研究通过将5株解淀粉芽孢杆菌分别接种于经盐酸配制为PH=2、PH=3和PH=4的LB肉汤中培养2h和胆碱盐浓度为0.3%的环境中培养5h以评价其在人工胃液肠液中的耐受性。结果显示5株菌株均具有不同的的耐酸、耐胆盐能力,其中菌株(YN-BA2)的耐受力最高。综上我们筛选出1株体外抑菌特性和体外耐受性最好的解淀粉芽孢杆菌YN-BA2。为了研究解淀粉芽孢杆菌对茶花鸡消化酶活性和盲肠菌群的影响,选取60羽7日龄健康茶花鸡(不区分公母),分为空白组(A组)和解淀粉芽孢杆菌饲喂组(BA组),每组10羽,设置3个重复,经口灌服灭菌LB肉汤培养基或1×10~8CFU/m L YN-BA2菌悬液500μL/羽/d,连续3d。分别于14日龄和21日龄时测定茶花鸡消化酶活性和盲肠菌群的变化。结果发现:与空白组组相比,14日龄和21日龄时BA组茶花鸡空肠消化酶中脂肪酶与胰蛋白酶活性均有所升高,但差异性不显著;盲肠菌群测序显示14日龄时BA组低于空白组,但差异性不显著,21日龄时BA组显著高于空白组,显著提高了茶花鸡盲肠微生物的多样性(P<0.05)。由此可见,连续3天灌喂YN-BA2,随着日龄的变大,能够提高茶花鸡多种消化酶活性,但差异均不显著,对消化酶活的影响不大;但是能提高盲肠微生物的多样性。为了探究解淀粉芽孢杆菌对鸡白痢沙门菌致茶花鸡肠道损伤的保护作用,本研究首先建立了鸡白痢沙门菌(YN-SP9)的感染模型,确定LD50为3.56×10~9CFU/m L。选取120羽1日龄健康茶花鸡(不区分公母),随机分为空白组(A组,经口灌喂500μL无菌LB肉汤,连续3d)、解淀粉芽孢杆菌组(BA组,经口灌喂500μL 1×10~8CFU/m L YN-BA2菌悬液),鸡白痢沙门氏菌感染组(SP组,7日龄时经口灌喂500μL鸡白痢沙门菌YN-SP9菌悬液)、预防组(BA预防组,灌喂致病菌后3d连续灌服YN-BA2菌悬液)和治疗组(BA治疗组,灌喂致病菌后连续灌服YN-BA2菌悬液3d),每组3个重复,每个重复10羽茶花鸡,饲喂基础日粮至21日龄,分别在14日龄和21日龄时测定各组茶花鸡空肠绒毛长度、隐窝深度和空肠绒毛长度/隐窝深度比值,研究空肠结构的变化;测定空肠碱性磷酸酶(ALP)和髓过氧化物酶(MPO)、回肠鸡分泌型免疫球蛋白A(s Ig A)、血清白细胞介素10(IL-10)、血清肿瘤坏死因子α(TNF-α)和十二直肠中禽β防御素6(Av BD6)水平,研究YN-BA2对茶花鸡肠道功能和机体免疫的影响。结果显示:与SP组相比,14日龄与21日龄时,BA预防组和BA治疗组空肠绒毛长度与空肠绒毛长度/隐窝深度比值均有不同程度的改善(P<0.05);空肠ALP活性升高MPO活性降低(P<0.05),回肠s Ig A的表达水平下降(P<0.05),血清中IL-10水平上调(P<0.05),TNF-α水平下降(P<0.05),影响了十二直肠Av BD6的合成。由此可见,感染鸡白痢沙门菌(YN-SP9)前后饲喂YN-BA2,能够改善茶花鸡空肠结构损伤,提高肠粘膜屏障功能和机体免疫能力。综上,本研究从10份鸡场环境土壤及5份健康鸡肠道内容物中共分离到5株解淀粉芽孢杆菌,通过体外抑菌试验和耐受性评价,筛选出1株抑菌作用和耐受性最优的解淀粉芽孢杆菌YN-BA2。YN-BA2可显著改变健康茶花鸡盲肠微生物菌群结构;感染前后饲喂YN-BA2可显著改善鸡白痢沙门菌感染造成的茶花鸡空肠结构损伤,提高肠粘膜屏障功能和机体免疫能力。
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