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背景及目的:膀胱癌是国人泌尿生殖系统最常见恶性肿瘤之一。肌层浸润性膀胱癌在全球最常见的死亡原因中排名第9位,在发达国家中,是男性第4常见的癌症类型。近年来,膀胱癌的发病率与病死率在我国也呈逐年上升趋势,是严重危害我国居民健康的重要疾病之一。尽管大部分初诊患者表现为非肌层浸润性膀胱癌,经治疗后其预后较好且94%的患者能够生存大于5年,但其复发率高达50-70%,而且30%患者会进展为高级别高分期的肌层浸润性膀胱癌,发展为肌层浸润性膀胱癌的患者5年生存率低于50%。尽管近年来,针对膀胱的研究取得了很多重要的进展,但是膀胱癌患者的死亡率一直没有改善。究其原因,可能与膀胱癌缺乏特异的治疗靶点有关。自噬是一种细胞成分（细胞内蛋白质或细胞器）的自我降解的动态过程,对于应激条件下的维持细胞生存状态起着重要作用。该过程的失调与包括癌症在内的多种人类疾病有关。自噬既可以促进肿瘤发生发展（称为保护性自噬）,自噬的过度激活可能导致自噬性细胞死亡（又称细胞毒性自噬）。对癌细胞进行重编程使其发生毒性自噬诱导肿瘤细胞死亡在目前看来是治疗肿瘤的一种可行的策略。MiRNAs在肿瘤细胞的增殖、凋亡、焦亡、铁死亡、侵袭、转移、耐药、免疫逃逸及肿瘤干细胞干性等生物学功能中起着重要的调节作用,与肿瘤的发生发展密切相关。MiRNA-221,作为一个癌基因,在多数常见上皮性肿瘤细胞均表达上调,包括乳腺癌、直肠癌、前列腺癌、乳头状甲状腺癌,胰腺癌、肝细胞癌和肾癌等,也包括膀胱癌。然而miR-221在膀胱癌中的作用目前尚不清楚,miR-221是否参与调节自噬然后改变膀胱肿瘤的凋亡抗性、侵袭能力进而影响膀胱肿瘤的发生发展目前也暂无研究报道。且在膀胱癌中miR-221的表达受到哪些基因的调节目前也不得而知。多研究表明HMGA1在多种肿瘤中扮演着重要角色。HMGA1可以通过以下机制促进肿瘤发生发展:抑制p53基因的促凋亡作用,促进干细胞及炎症通路相关基因的表达,调节miRNAs及细胞周期和上皮间充质转化相关基因的表达。然而,HMGA1在膀胱癌中的作用目前是未知的。有文献报道,miR-221在宫颈癌中受到转录因子HMGA1的调控。此外,在多种癌细胞中,HMGA1可调节自噬促进肿瘤的进展。本课题我们将探究HMGA1和miR-221对膀胱癌细胞自噬的调控作用以及自噬在HMGA1和miR-221影响膀胱癌细胞增殖、侵袭及迁移能力中的作用,并阐明HMGA1和miR-221之间的调控关系及两者调控膀胱癌细胞自噬的相关基因和信号通路。方法:1、通过qRT-PCR检测膀胱癌细胞及永生化膀胱正常上皮细胞中miR-221的表达水平,并利用生物信息学的方法分析miR-221表达与膀胱癌预后的关系。还利用Western Blot检测、透射电镜、噬检测试剂盒（Cyto-ID Autophagy detection kit）及细胞免疫化学LC3染色等方法检测敲低miR-221之后膀胱癌细胞自噬体的变化。通过transwell细胞侵袭实验、划痕试验验证敲低miR-221对膀胱癌细胞侵袭迁移能力的影响。回复实验验证TP53INP1在敲低miR-221引起的膀胱癌细胞自噬及随之发生的侵袭迁移能力改变中的作用。另外通过裸鼠成瘤实验验证敲低miR-221对膀胱癌的体内增殖的影响。2、利用ERK1/2抑制剂U0126及RNA干扰的方法进行回复实验,验证ERK1/2信号通路及自噬在miR-221介导的膀胱癌细胞侵袭和迁移能力改变中的作用。3、通过生物信息学的方法研究TCGA数据库膀胱癌中miR-221的表达水平与HMGA1的相关性以及HMGA1在膀胱癌中的表达及预后关系。并使用RNA干扰的方法敲低HMGA1之后并利用qRT-PCR检测干扰HMGA1之后miR-221的表达水平。另外还通过免疫组织化学检测HMGA1在膀胱癌组织中的表达。4、通过CCK8试验检测敲低HMGA1后对膀胱癌细胞增殖的影响,利用Western Blot、自噬检测试剂盒及细胞免疫化学LC3染色等方法检测敲低HMGA1之后膀胱癌细胞自噬水平的变化。通过transwell细胞侵袭实验、划痕试验验证敲低HMGA1对膀胱癌细胞侵袭迁移能力的影响。5、通过回复实验验证miR-221在敲低HMGA1引起的膀胱癌细胞自噬及侵袭迁移能力改变中的作用。实验结果:1、抑制miR-221可升高TP53INP1诱导膀胱癌细胞自噬的发生并抑制膀胱癌的侵袭和迁移我们检测了常见膀胱癌细胞中的miR-221的表达,并发现在非肌层浸润膀胱癌细胞系5637细胞中,miR-221的表达明显低于正常对照SV-HUC-1;而肌层浸润性膀胱癌细胞系中,miR-221表达高于SV-HUC-1或与其表达水平接近。生物信息学的方法分析了miR-221表达与膀胱癌预后的关系,结果提示miR-221表达较高的膀胱癌患者预后较差。抑制miR-221后可诱导膀胱癌细胞自噬的发生。通过我们利用Western Blot检测及双荧光素酶报告基因实验,我们发现TP53INP1可以作为miR-221的靶基因。另外通过进一步的回复实验发现敲低miR-221引起的膀胱癌细胞自噬及随之发生的侵袭迁移能力的减弱依赖于TP53INP1/p-ERK1/2轴。另外通过裸鼠成瘤实验我们还发现敲低miR-221可以在体内抑制膀胱癌的增殖。2、MiR-221的促癌作用依赖于ERK1/2信号通路而抑制miR-221引起的膀胱癌细胞侵袭迁移能力的下降依赖于自噬通过表达miR-221可以促进膀胱癌细胞的侵袭和迁移能力并且通过抑制TP53INP1激活ERK1/2信号通路。MiR-221的促癌作用依赖于ERK1/2信号通路。通路干扰ATG5来抑制自噬可以在一定程度上抵消敲低miR-221引起的膀胱癌细胞侵袭迁移减少。3、HMGA1与miR-221的表达正相关且在膀胱癌中高表达我们通过生物信息学的方法发现TCGA数据库膀胱癌中miR-221的表达水平与HMGA1正相关,miR-221的表达水平与TP53INP1负相关,且HMGA1的表达与TP53INP1负相关。干扰HMGA1之后miR-221的表达水平也随之降低,而TP53INP1的m RNA水平则升高。另外TCGA数据库中HMGA1在膀胱癌中表达明显高于癌旁组织。且HMGA1表达较高的膀胱癌患者预后较差。我们还通过免疫组织化学检测了64例膀胱癌组织及其对应的48例癌旁组织中HMGA1的表达水平。结果提示HMGA1在膀胱癌组织中高表达。4、敲低HMGA1可诱导膀胱癌细胞自噬的发生并抑制膀胱癌细胞增殖、侵袭和迁移,且敲低HMGA1介导的这种效应依赖于自噬通过CCK-8细胞活性试验我们发现干扰HMGA1的表达后可明显抑制膀胱癌细胞的增殖。通过Western Blot检测、Cyto-ID自噬检测试剂盒及LC3细胞免疫荧光染色检测我们发现干扰HMGA1的表达可以诱导膀胱癌细胞自噬的发生。此外,我们还发现干扰HMGA1的表达可以抑制膀胱癌细胞的克隆形成的能力及侵袭和迁移能力。并且抑制HMGA1引起的膀胱癌细胞增殖、侵袭及迁移能力的下降在一定程度上依赖于自噬。5、HMGA1沉默介导的自噬及其对膀胱癌细胞的影响依赖于miR-221/TP53INP1/p-ERK1/2轴MiR-221 mimic可以在一定程度上抵消HMGA1沉默引起的膀胱癌T24细胞克隆形成、侵袭和迁移减弱的作用及HMGA1沉默介导的自噬。敲低HMGA1可以抑制miR-221的表达并增加TP53INP1的表达。敲低HMGA1还可以抑制膀胱癌细胞的增殖、侵袭及迁移。敲低HMGA1引起的对膀胱癌生物学功能抑制的这种效应在一定程度上依赖于自噬,并且miR-221可以部分抵消这种效应。此外,miR-221 mimic可部分抵消HMGA1沉默引起的自噬。且miR-221 mimic能在一定程度上rescue敲低HMGA1后引起的TP53INP1升高及p-ERK1/2的降低。结论:我们发现miR-221在大部分肌层浸润性膀胱癌细胞中高表达,且高表达miR-221的膀胱癌患者预后较差。通过细胞学实验我们发现miR-221可以通过靶向TP53INP1促进膀胱癌细胞的侵袭和迁移,体内实验发现miR-221可以促进膀胱癌的增殖。敲低miR-221可以升高TP53INP1诱导膀胱癌细胞自噬的发生并抑制膀胱癌细胞的侵袭和迁移能力。另外,我们发现HMGA1与miR-221的表达正相关,干扰HMGA1的表达可以下调miR-221。HMGA1在膀胱癌及膀胱癌细胞系中高表达,高表达HMGA1的膀胱癌患者预后较差。通过体外实验我们发现干扰HMGA1可以抑制miR-221并升高TP53INP1诱导膀胱癌细胞自噬的发生并抑制膀胱癌细胞的侵袭和迁移能力。综上所述,我们的研究表明HMGA1可以通miR-221/TP53INP1/p-ERK1/2轴调控膀胱癌的自噬及侵袭迁移,HMGA1及miR-221可以作为膀胱癌治疗的潜在靶点。