目的免疫球蛋白样转录子(ILTs)是最近发现的一类受体家族,主要表达于髓系和淋巴系细胞表面,其成员通过与相应配体结合,在诱导免疫活性T、NK细胞分别转化为Treg和耐受性NK细胞,促进NK、T细胞的凋亡等发挥着广泛的免疫调节作用。环孢菌素A(CsA)是一种临床常用的免疫抑制剂,多用于器官移植后抗排斥反应,治疗自身免疫性疾病等。以往研究表明抑制性受体ILT3和ILT4可使宿主对外源性的器官产生耐受,上调其表达可提高移植成功率。关于CsA对机体免疫功能的调节以往虽有研究,但该药物对人淋巴细胞ILTs表达的影响未见报道。本研究在前期工作的基础上,体外实验中以自然杀伤细胞(NKL)为研究对象,分别用不同浓度CsA处理NKL细胞,检测用药前后细胞抑制性受体ILT3和ILT4表达、NKL细胞增殖及其对肿瘤细胞杀伤功能的变化；同时,动态检测肾移植患者(使用CsA抗排斥反应)手术前后外周血淋巴细胞ILT3和ILT4mRNA的表达变化,比较肾移植术后稳定组与排斥组ILT3/4表达差异,分析ILT3/4的表达与肾移植术后排斥反应的联系,探讨ILT3/4在诊断排斥反应中的应用。该研究对探索CsA的作用机制及其合理应用具有重要参考价值,对肾移植术后排斥反应的早期诊断具有显著的临床意义。方法一、体外实验：1、分别用浓度为5、10、15mg/L的CsA处理NKL细胞12h、24h、36h后,采用定量PCR和流式细胞术,分别检测用药前后NKL细胞抑制性受体ILT3和ILT4mRNA和蛋白的表达；2、测定肿瘤细胞BGC-823和JEG-3上HLA-G的表达,并选择经浓度为15mg/L的CsA处理36h前后的NKL细胞分别与表达不同程度HLA-G的肿瘤细胞BGC-823和JEG-3共培养,采用MTT法检测药物处理前后NKL细胞对肿瘤细胞BGC-823和JEG-3杀伤活性变化；3、MTT法检测经不同浓度CsA处理前后的NKL细胞增殖活性的变化。二、临床实验：实验分组包括实验组、健康对照组及术前对照组。其中实验组来自齐鲁医院器官移植中心接受肾移植的患者,根据患者术后恢复情况又分为术后排斥组和术后稳定组；随机选取山东大学齐鲁医院健康体检职工作为健康对照组。采用实时荧光定量PCR法检测肾移植患者手术前后(术后1天、1周、3周、1个月、两个月及3个月)、发生排斥反应前后(排斥发生时、发生后1天、3天、7天)及健康对照组外周血淋巴细胞ILT3和ILT4mRNA的表达变化。同时检测各研究对象同期外周血CsA药物浓度及血清肌酐和尿素氮等指标,分析ILT3和ILT4在移植排斥反应的发生发展及临床诊断中的作用。所取标本均经研究对象同意,符合山东大学齐鲁医院伦理委员会要求。结果1、CsA可上调NKL细胞ILT3和ILT4的表达,且上调幅度与处理时间、药物浓度相关。其中15mg/L的CsA处理NKL细胞36h后,细胞ILT3和ILT4表达明显升高；2、对同一种靶细胞,经浓度为15mg/L的CsA处理后的NKL细胞杀伤效率较处理前明显下降；药物处理前后的NKL对低表达HLA-G的BGC-823细胞杀伤力均强于对高表达HLA-G的JEG-3细胞的杀伤；3、各浓度组CsA不同程度的抑制NKL细胞的增殖,同一时间段,随着CsA浓度的增大,对NKL细胞增殖的抑制作用逐渐增强,呈一定的剂量效应；且同一浓度处理NKL细胞时间越长,抑制其增殖的作用越明显；4、临床实验中,实验组与对照组中不同个体ILT3/4mRNA表达水平高低不一,存在较大个体差异。但整体来看,术前对照组ILT3/4mRNA表达与健康人对照组无明显统计学差异；5、术后功能稳定组：术后1天,ILT3mRNA表达较术前无明显变化,ILT4mRNA略升高；术后7天ILT3/4mRNA与术前水平相比均有升高；随后,ILT3/4mRNA表达水平持续上升,于术后大约一个月达到最高表达水平；术后2个月及3个月,ILT3/4表达水平基本保持稳定,分别约为术前的1.69-1.73、2.06-2.12倍；6、术后排斥反应组：从术后到排斥反应发生前各时间段ILT3/4mRNA表达水平与稳定组相应时间段无显著差异；出现排斥时ILT3/4mRNA的表达水平明显低于排斥前稳定水平,同时也略低于术前水平。随后,患者在使用适量免疫抑制剂后ILT3/4的表达呈现不同程度的上升。结论1、CsA可上调NKL细胞上ILT3和ILT4的表达,并通过ILT3和/或ILT4参与对NKL细胞杀伤及增殖功能的调节,同时ILT3和/或ILT4可与HLA-G相互作用影响NKL细胞对肿瘤的杀伤功能。另外,ILT3/4上调幅度与药物浓度等相关。这将为探讨CsA作用机制及其在临床上的合理应用提供重要参考价值；2、动态检测肾移植患者术前、术后及排斥反应发生前后外周血淋巴细胞ILT3/4表达变化结果发现：移植术后稳定组患者外周血淋巴细胞ILT3/4较术前均呈现不同程度的表达上升。而排斥组患者出现排斥反应时其ILT3/4的表达较稳定组及排斥反应前稳定期明显下降。ILT3/4对排斥反应的早期诊断具有重要价值。综上所述,抑制性受体ILT3和ILT4在肿瘤及移植术后排斥反应的发生发展具有重要作用,其有望成为器官移植术后排斥反应及肿瘤临床诊断和疗效观察的无创性检测指标。