目的:体细胞胚胎发生(Somatic embryogenesis)是棉花(Gossypium hirsutum L.)通过农杆菌介导的遗传转化最关键的步骤之一,通常包括非愈伤组织的诱导、胚性愈伤组织的分化、胚状体的形成以及胚状体发育成苗等过程。棉花体细胞胚胎发生存在的缺点是基因型依赖、培养周期长、不正常胚产生效率高,严重制约了棉花基因功能的验证和转基因育种工作。研究棉花体细胞胚胎发生的生理及分子机制可以为棉花组织培养及转基因育种工作提供重要的理论依据和技术支撑。方法:(1)本研究使用de novo转录组测序和iTRAQ蛋白组测序的方法,测定了新疆陆地棉品种新陆早33号体细胞胚胎发生过程中非胚性愈伤组织、胚性愈伤组织以及胚状体中的差异表达基因和蛋白,并对差异表达基因和蛋白进行了鉴定及表达模式分析。(2)对差异表达基因和蛋白的相关通路进行了注释和分类,进一步明确了参与调控棉花体细胞胚胎发生的通路。(3)利用qRT-PCR、内源含量测定以及外源添加等实验,明确相关基因、蛋白及通路与棉花体细胞胚胎发生的关系。(4)用HPLC法,提取分离鉴定了棉花内源多胺的种类,建立棉花组织多胺提取测定的技术体系。(5)通过分析多胺代谢途径相关生理生化指标、基因表达、ELISA法测定相关酶活性、生理互补实验等,揭示多胺调控棉花体细胞胚胎发生的可能机制。结果与结论:(1)De novo转录组测序一共获得了101,670个unigene,在胚性愈伤组织向胚状体转化过程中差异表达的基因多于非胚性愈伤组织向胚性愈伤组织转化过程中的差异表达基因。大量的差异表达基因参与了植物激素合成及信号转导、胁迫响应反应、ROS平衡以及多胺代谢等途径。用qRT-PCR验证了相关差异基因的真实性和准确性。内源IAA和KT含量变化规律与其合成途径相关基因的表达模式一致。外源IAA和KT能够促进胚性愈伤组织向胚状体的转化,不同浓度IBA的添加会对非胚性愈伤组织、胚性愈伤组织的诱导效率有影响,外源添加多胺和过氧化氢也能在很大程度上促进胚状体的形成。适当的胁迫条件对胚性愈伤组织的增殖以及胚状体形成都有促进作用。此外,赤霉素、脱落酸、乙烯、油菜素内酯、水杨酸、茉莉酸及脂肪酸途径相关基因也呈现出差异表达的规律。转录组动力学分析表明不同植物激素间的平衡调控,多胺代谢和胁迫响应过程协同调控了棉花体细胞胚胎发生。(2)iTRAQ蛋白组测序发现,三组样品中一共得到了5892个差异表达蛋白,这些蛋白主要参与了催化活性、结合活性、转运活性以及结构分子活性,其中93.4%的差异蛋白在分子功能水平参与了结构分子活性。差异表达蛋白统计分析发现,与非胚性愈伤组织相比,胚性愈伤组织中分别有572个上调表达蛋白和452个下调表达蛋白;与胚性愈伤组织相比,胚状体中分别有211个上调表达蛋白和647个下调表达蛋白。KEGG分析显示遗传信息的转运、植物激素合成及信号转导、糖酵解过程、脂肪酸合成和代谢以及半乳糖代谢等通路参与了棉花体细胞胚胎发生。通过qRT-PCR分析相关差异基因在三个时期的表达情况进一步确定了蛋白组测序的真实性和准确性。对转录组和蛋白组的测序数据进行关联分析发现,所测得基因序列和蛋白序列的关联系数为0.27,差异表达基因与差异表达蛋白的关联系数高于0.6。(3)建立了棉花组织多胺提取分离及测定的高效液相色谱法,可将腐胺、亚精胺、精胺在15分钟完全分离并定量测定,线性关系良好(r>0.99),回收率高(96.8%~103.1%)。测定棉花体细胞胚胎发生各时期内源多胺的含量,结果显示在胚性愈伤组织以及体细胞胚形成初期,三种类型多胺含量显著提高,腐胺的含量在胚状体中有下降趋势,而亚精胺和精胺的含量在胚状体中没有变化。多胺合成相关基因的表达量分析发现,棉花精氨酸合成酶GhADC在体细胞胚胎发生过程中的表达与多胺含量(尤其是腐胺含量)的变化规律非常一致。此外,多胺代谢产物H2O2的含量在胚性愈伤组织时期也有显著的提高,与多胺氧化酶GhPAO1和GhPAO4的表达规律一致。ELISA酶活测定发现,多胺氧化酶PAO在胚性愈伤组织中表现出较高的活性,抑制PAO活性则表现出体细胞胚胎形成受阻。多胺及其代谢产物H2O2都能够促进胚性愈伤组织的生长及胚状体的形成,同时也能够降低多胺合成抑制剂D-arginine及多胺氧化酶抑制剂1,8-DO的抑制效果。多胺代谢途径另一个重要的信号分子NO的含量在体细胞胚胎发生过程中变化不明显,且对体细胞胚胎发生没有显著作用。综合上面的结果,我们得出结论:多胺可能通过多胺氧化酶调节其代谢产物过氧化氢来调控棉花体细胞胚胎发生。