论文部分内容阅读
胆固醇酯酶(CHE：EC3.1.1.13)是一种重要的甾体酯酶，在食品、医药、造纸等方面有着广泛的用途。本研究的目的是为医药与工业提供合适的酶源，主要开展了以下几个方面工作。
首先，经过筛选从大型肉食动物肠道中获得9株胆固醇酯酶高产菌株，其中1株表现出高于其他菌株的产酶能力，命名为CHE4-1。经形态及生理生化鉴定、16S rDNA(GenBank登录 ID号：FJ649602)分析，CHE4-1鉴定为Acinetobactersp．。迄今为止，未见不动杆菌属(Acinetobacter)产胆固醇酯酶的报道。
其次，对该菌株的生长与产酶条件进行了研究，提出了分段控制的发酵策略。产酶条件优化研究表明，其最适培养基为：胆固醇油酸酯0.2％，用0.15％TritonX-100助溶，蛋白胨0.05％，NaNO30.008％，硼酸0.0075％，CaCl20.03％，MgSO4.7H2O0.0125％，FeSO4.7H2O0.0005％，KH2PO40.037％；其最适培养条件为：起始pH6.9，250ml发酵瓶最佳装液量为35ml，30℃，发酵时间48 h；酶活力达到950U/L。
然后，对胆固醇酯酶进行纯化。发酵上清液经超滤浓缩，DEAE—Sepharose离子交换层析、Phenyl—Sepharose CL-4B疏水层析和 Superdex-50凝胶层析分离纯化获得胆固醇酯酶。纯化后的胆固醇酯酶比活力为7.15 U/mg，纯化收率为27.02％，纯化倍数为9.67倍。纯化后的胆固醇酯酶经HPLC纯度检测达98.22％，SDS—PAGE为单一条带。SDS—PAGE和Superdex-75凝胶层析分析显示为约6.5kDa的单链蛋白，是目前为止所发现的最小的胆固醇酯酶。
最后，对胆固醇酯酶的酶学特性进行了研究，结果表明，该胆固醇酯酶的pH稳定范围为4-10；最适pH和最适温度分别为pH7.0和45℃，该酶催化胆固醇亚油酸酯、胆固醇油酸酯的米氏常数Km分别为1.75×10-3mol/L、5.36×10-4mol/L。该酶对长链和短链胆固醇酯均具有较高的催化活力。大多数金属离子对胆固醇酯酶抑制作用不明显；Ca2+、Zn2+、硼酸对胆固醇酯酶有微弱激活作用；Cu2+、TritonX-100对胆固醇酯酶不具明显作用，显示了良好的临床应用价值。