心血管疾病在美国乃至全世界导致的死亡率非常高,糖尿病、高血压、高血脂、肥胖、酒精以及不健康的饮食都将进一步引发心脑血管疾病,中风、高血压和心肌梗死是最常见的心脑血管疾病[1,3-5]。其中动脉粥样硬化疾病(Atherosclerosis,AS)是导致各种各样的心血管疾病的主要原因,对人类生命健康具有很大的影响。目前应用比较广泛的抗动脉粥样硬化药物多数都是以降血脂作为主要目的地药物,包括他汀类药物、贝特类药物、烟酸类药物、胆汁酸隔离剂等药物。这些药物虽然具有一定的防治AS的疗效,但是部分药物,例如胆汁酸隔离剂类、烟酸类和贝特类药物不但具有易耐受、选择性低等局限性,而且容易产生肝肾功能的损害、胃肠道不适等副作用;而使用最为广泛的他汀类药物虽然具有较好的疗效,但是由于其易耐受,动脉粥样硬化的发生率仍然得不到控制,并且其具有肝脏毒性、肌肉疼痛、糖尿病风险等毒副作用。即便目前人们大量使用他汀类药物治疗和预防AS,全球因为AS而引起的各种心血管疾病的发病率和致死率仍然居很高。这表明,我们有必要对动脉粥样硬化的治疗进一步研究,找到一种疗效好、而毒副作用低的药物是一种必然趋势。近期的相关研究表明,固醇调节元件结合蛋白2(SREBP2)非编码区域上的微小RNA33(miR-33),参与调节很多与细胞内外胆固醇(TC)转运相关的一些基因,并且能够上调其基因和蛋白的表达,例如ATP结合转运蛋白A1(ABCA1)和ATP结合转运蛋白G1(ABCG1),而两个基因也同时参与了AS中TC的逆转运(RCT),ABCA1将胆固醇从细胞内转运载脂蛋白A1,从而生成HDL,利于胆固醇的转运;ABCG1转运胆固醇形成更大的α-HDL,从而被肝脏清除,这两个基因与AS的发生及发展紧密相连。在人类和非人类灵长动物中,ABCA1的3’非翻译区(UTR)包含3个高度保守的miR-33结合位点;小鼠的ABCA1和ABCG1都具有miR-33结合位点。有研究证明,基于不同AS实验动物模型,随着miR-33的增多,ABCA1m RNA将上调,其蛋白的表达也相应增多。而在肝脏和巨噬细胞中,有研究表明,miR-33的过量的表达降将低TC流出到ABCA1,而该过程是高密度脂蛋白(HDL)产生的重要环节。在小鼠中,miR-33还同时靶向ABCG1,并抑制蛋白的表达,因此同时也一样减少TC流出到HDL。综上所述,通过反义核苷酸anti-miR-33(ANM33)抑制miR-33的表达是防治AS的有效新策略。不过,目前依然缺乏有效的载体系统以实现ANM33的靶向递送。课题组前期研究发现,口服酵母微囊能够靶向于动脉粥样硬化斑块部位;基于此,本研究设想通过酵母微囊来实现ANM33的靶向递送以防治动脉粥样硬化。为此,首先采用酸碱法制备酵母微囊,通过枝化聚乙烯亚胺(PEI,分子量为25 k Da)处理酵母微囊使其带正电荷,进而包裹带负电荷的ANM33,最终构建ANM33/酵母微囊递送系统(ANM33/YS)。通过口服给药的方式,以载脂蛋白E基因敲除(Apo E-/-)小鼠建立AS模型,并对所构建的ANM33/YS开展体内外治疗效果和安全性评价,从而为酵母微囊递ANM33靶向治疗小鼠AS提供相应的实验依据和理论基础。方法:一、口服酵母微囊(YS)的制备、预处理及其表征1、酵母去核25.0 g酵母加入250 ml 1 M的Na OH溶液中,80℃搅拌1 h之后,离心(2000 g,10min),分散于250 ml蒸馏水中,用浓盐酸调p H至4-5。55℃搅拌1 h,然后离心(2000g,10 min),依次采用蒸馏水洗一次,异丙醇洗四次,丙酮洗2次,常温干燥后封口胶封口保存。2、异硫氰酸荧光素(FITC)标记PEI(PEI-FITC)的合成FITC配制成2 mg/ml的二甲基亚砜(DMSO)水溶液备用。PEI配制成8 mg/ml的DMSO溶液。将5.5 ml PEI溶液和2 ml FITC溶液混合,于40℃恒温避光反应4 h,之后透析24 h。3、PEI-FITC处理YS采用不同量的PEI-FITC结合物处理等量YS,PEI与YS质量比分别为1:1、1:2、1:3、1:4和1:5,最后通过紫外分光光谱法测定包封率。4、PEI处理YS制备2 mg/ml的YS混悬液,然后制备8 mg/ml的PEI水溶液。按照质量比1:2来处理YS,37℃搅拌24 h,离心(5000 rpm,5 min),无RNA酶蒸馏水洗四次离心(5000rpm,5 min)后干燥即得。5、YS对ANM33的负载分别使用1、3、5、7、9、11μg的Cy3标记的ANM33与4 mg YS,37℃搅拌3h,离心后,通过测定上清液中的荧光强度计算YS中ANM33的负载量。6、ANM33/YS的制备最终采用4 mg YS与7μg(1nmol)ANM33反应来批量制备ANM33/YS,在37℃下孵育3 h,水洗离心(5000 rpm,5 min)后室温干燥。7、微粒理化性能表征分别将不同微粒在蒸馏水水中分散,制备成1 mg/ml的混悬液,分别测定表面Zata电位和粒径。通过透射电子显微镜、激光共聚焦显微镜进行拍照观察。二、细胞实验1.细胞吞噬实验小鼠腹腔巨噬细胞细胞系(RAW264.7)在六孔板中培养贴壁,其中加入的ANM33/YS的剂量为26 pmol/ml(按ANM33计算),分别考察0、1、2、4、6、8 h不同时间点的吞噬量,考察的浓度梯度为0、6.5、13、26、52 pmol/ml,其吞噬时间为4 h。分别进行激光共聚焦观察和流式分析。2.细胞存活率测定实验RAW264.7巨噬细胞于96孔板中培养贴壁,在生长状态良好的情况下加入ANM33/YS,给药24 h,洗涤后通过MTT法测定巨噬细胞存活率。3.RT-PCR分析RAW264.7细胞在六孔板中培养贴壁,其中加入的ANM33/YS的剂量为26pmol/ml,孵育时间为24 h,最后通过RT-PCR测定ABCA1和ABCG1对应m RNA的表达。三、动物实验1.实验动物及其处理雄性Apo E-/-小鼠40只,18~20 g,8周龄,饲养一周后,随机分成四组(n=10):第一组为模型组,其余三组分别为高低剂量ANM33/YS组和结合有PEI的anti-mir-33(PANM33)组。每隔两天给小鼠灌胃给药一次,四组别给予等量磷酸缓冲盐(PBS)、20μg/kg(PANM33)、6.67和20μg/kg的ANM33/YS,灌胃给药12周,给药期间均给予高脂饲料喂养。每周记录一次体重,12周后处死。2.Apo E-/-小鼠主动脉油红O染色在体式显微镜下,去掉主动脉周围脂肪组织,用实验用手术器材纵向剖开血管,于新鲜配制的油红O溶液中染色20 min,将血管取出,在PBS中涮洗三次,再于体式显微镜下采用镊子将血管外膜剥离去除,将血管小心铺平在载玻片上,盖上盖玻片,光学显微镜下拍照观察。3.血常规和生化指标检测处死小鼠后采集血液样品,血液保存于1.5 ml离心管中,分别吸取20μl进行血常规检测,剩余血液于4℃放置半小时,之后离心(3000 rpm,10 min),离心后收集血清用于检测肝肾功生化指标。4.免疫组化对主动脉根部冰冻切片,分别进行苏木精-伊红染色(HE),免疫组化单核巨噬细胞CD68染色、平滑肌细胞α-肌动蛋白(α-Actin)染色、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)染色及Ⅰ型胶原蛋白Masson染色。5.组织病理学分析将小鼠的心、肝、脾、肺、肾和肠组织取材放于4%对聚甲醛固定,石蜡包埋切片(5μm),HE染色。结果:1.在透射电镜下,酵母经酸碱法处理后,可以明显看到酵母内容物被除去。2.通过共聚焦显微镜观察及测定zeta电位的变化可以发现,经过FITC标记的PEI和经过Cy3标记的ANM33都能够较好的包裹于YS;在共聚焦显微镜下,可看到YS中PEI-FITCI显绿色荧光,ANM33-Cy3显红色荧光。3.采用RAW264.7巨噬细胞YS结果显示,随着时间的增加,细胞吞噬YS增加;同样的吞噬时间,细胞吞噬量随着YS的剂量的增大而增大。由此可以看出,YS能够有效被巨噬细胞吞噬,且吞噬行为具有时间和浓度依赖性。4.RT-PCR结果分析表明,采用YS递送ANM33能够增加细胞中ABCA1和ABCG1m RNA的表达。5.对小鼠主动脉血管外膜剥离后,进行油红O染色,光镜下观察显示PBS对照组(模型组)主动脉有大量斑块形成,病变面积达33.73%,而20μg/kg的ANM33/YS组(高剂量组)主动脉板块面积显著下降为12.27%,6.67μg/kg的ANM33/YS组(低剂量组)为19.86%,20μg/kg的PANM33组小鼠斑块面积为17.73%。6.小鼠肝肾功分析结果表示,高低剂量组与模型组对比,LDL、TCH下降,具有显著统计学差异;高低剂量组与无载体组对比,TCH下降,HDL升高,具有显著统计学差异。7.冰冻切片免疫组化及HE染色结果表明药物增加主动脉斑块的稳定性。8.小鼠组织病理石蜡切片HE染色结果表明,各组小鼠的体内脏器并没有明显的病变。结论:1.通过制备去核酵母微囊,采用PEI对微囊进行处理,能够成功地负载反义核苷酸ANM33。2.ANM33/YS微囊系统可较好地被RAW264.7细胞吞噬;且RT-PCR结果表明,ANM33/YS可通过沉默miR-33提高细胞内ABCA1和ABCG1的表达。3.灌胃给药高剂量ANM33/YS 12周后,Apo E-/-小鼠主动脉斑块面积显著低于对照组,表明其对小鼠AS具有一定的疗效。4.初步安全性评价表明,YS对巨噬细胞的细胞毒作用较小。小鼠组织HE病理切片结果表明,ANM33/YS口服微囊递送系统并没有引起组织明显病变。