HIV病毒是艾滋病的病原。它在艾滋病病人体内以两种方式存在：既存在于被感染的CD4+细胞中，同时又以游离形式存在于血循环中。如果能有效清除这两种存在方式的HIV病毒，将从根本上治愈艾滋病。历史上，曾有过CD4-PE40（绿脓杆菌毒素Ⅱ-Ⅲ区段）的基因工程设计，试图达到上述目的，但由于作为人体异源蛋白的PE40具有强烈的免疫原性而告失败。有鉴于此，本研究试图构建并研制一类具有良好安全性和特异性的靶向性融合蛋白。本研究试图寻找一种可以广泛应用的人源的、具有杀细胞活性的因子来治疗艾滋病的策略。如把肿瘤坏死因子alpha和穿孔素作为杀细胞因子。为解决其特异性问题以最大限度降低毒副作用所采取的技术步骤是把这类杀细胞因子构建并研制成准确的靶向性融合蛋白。首选的功能分子是TNFα。由于其过大的毒副作用以致临床上不能用于治疗恶性肿瘤。本研究试图通过将原型的TNFα进行突变，获得高效低毒的突变体，在保持杀细胞功能的同时降低毒副作用。加之靶向设计，可进一步降低其毒副作用提高安全性。为最大限度降低重组融合蛋白的免疫原性问题，主要的技术路线有两点：组成融合蛋白的相关基因片段均为人源；预期所构建的融合蛋白的组成部分可分别基本保持其原有的三维结构，以避免被免疫系统错误识别为异源蛋白，以致产生抗体而最终导致药物失效。靶向性融合蛋白由靶向分子和效应分子组成，均为来源于人体正常组织的蛋白。只有HIV/SIV病毒感染细胞和游离的HIV/SIV才会表达gp120，正常细胞不会表达gp120。融合蛋白的靶向分子可以特异地结合gp120，一方面，融合蛋白通过gp120调节的细胞内化作用进入病毒感染细胞，融合蛋白的效应分子可致死细胞；另一方面，靶向分子可以结合HIV/SIV病毒感染细胞和游离病毒的gp120而使其失去感染能力，抑制病毒扩散，保护正常细胞。因此，本研究的靶向性融合蛋白是一类双功能的活性多肽。这样的设计，既最大程度地降低了免疫原性，也极大地避免了药物对正常组织细胞的毒副作用。本课题设计并实施了三个系列的这类设计方案。鉴于HIV与SIV在生物学性质方面有平行关系，细胞活性试验以SIV作为试验对象。本研究共分三部分。第一部分：TNFαml类靶向性融合蛋白的研究本实验室构建的强效突变体TNFαml是利用PCR技术将TNFαN端第一位氨基酸Val前增加两个氨基酸Gly，Thr在其后增加三个氨基酸Arg，Gly，Pro成为TNFαml。融合蛋白CD4V1 TNFαml：选取CD4分子与gp120特异结合的关键结构域，即CD4的V1区（100个氨基酸，第1位-第100位）作为靶向分子，与TNFαml的N端融合构建成融合蛋白CD4V1 TNFαml。融合蛋白RNTNFαml：选取趋化因子受体CCR5的N末端（RN，第1位-第30位30个氨基酸），作为靶向部分与TNFαml的N端融合构建成融合蛋白RNTNFαml。融合蛋白XETNFαml：根据文献报道，本课题选取趋化因子受体CXCR4的第二个胞外环区（XE，第1位-第27位27个氨基酸）作为靶向分子，与TNFαml的N端融合构建成融合蛋白XETNFαml。融合蛋白XERNTNFαml：由于利用CCR5的病毒株（R5）感染数年后往往要转变为利用CXCR4的病毒株（X4），在本研究中探索性地将XE与RN串连作为靶向分子与TNFαml的N端融合构建成融合蛋白XERNTNFαml，以期获得双嗜性的靶向分子，可以在AIDS的不同疾病进程起作用。为了在E.Coli系统中获得较好的表达，靶向分子的编码序列均为E.Coli嗜好。将表达上述融合蛋白的表达重组体分别转入表达宿主菌DH5α和BL21，筛选得到高表达菌株pCW-XETNFαml／DH5α、pCW-CD4V1TNFαml／DH5α、pCW-XERNTNFαml／DH5α以及pET30-RNTNFαml／BL21。分别通过温度诱导及IPTG诱导，经激光密度扫描，表达蛋白在总蛋白中的含量分别为27.4％、10.8％、14.2％及15.6％。通过SDS-PAGE切胶回收纯化目的蛋白。用上述四种融合蛋白处理被SIV感染的CEMx-174细胞。杀伤试验中，设立被SIV感染的CEMx-174细胞为对照，同时设立融合蛋白作用于正常CEMx-174细胞的安全性对照和TNFα作用于SIV感染细胞的对照；中和试验中，设立被SIV感染的CEMx-174细胞为对照。均以2.0×10⁵／ml数量的CEMx-174细胞作为试验对象。结果显示：（1）杀伤试验中，四种融合蛋白实验组OD值均显著低于对照组（p＜0.05），并有良好的剂量—效应关系。1) 8、16、32、64、128μg／ml剂量范围内，XETNFαml的杀伤率分别为17.3％，2.9％，8.7％，45.4％，54.9％；2) CD4V1TNFαml的杀伤率分别为9.5％，26.7％，32.0％，44.3％，52.4％；3) XERNTNFαml的杀伤率分别为13.7％，24.5％，31.9％，37.1％，45.6％；4) RNTNFαml的杀伤率分别为16.2％，20.3％，28.2％，31.7％，33.7％。而TNFα蛋白在此剂量范围下对SIV感染细胞无杀伤作用（P＞0.20）。同时，四种融合蛋白在该剂量范围内作用于未感染SIV的CEMx-174细胞，对正常的细胞无杀伤作用（p＞0.20），符合试验设计的要求。杀伤试验后的滴度试验中，在各个剂量下，1) XETNFαml将病毒滴度由1：5120分别降至1：640，1：320，1：160，1：40，1：20；2) CD4V1TNFαml将病毒滴度由1：5120分别降至1：1280，1：640，1：80，1：40，1：10；3) XERNTNFαml将病毒滴度由1：5120分别降至1：1280，1：640，1：320，1：160，1：40；4) RNTNFαml将病毒滴度由1：5120分别降至1：2560，1：640，1：160，1：40，1：40。随着药物剂量的增加，病毒滴度也逐渐下降，药物剂量与病毒滴度的下降之间有良好的剂量—效应关系。（2）中和试验中，四种融合蛋白实验组OD值均显著高于对照组（p＜0.05），并有良好的剂量—效应关系。1)在2，4，8，16，32μg／ml剂量范围内，XETNFαml的保护率分别为12.7％，15.7％，26.6％，33.5％，40.2％；2) CD4V1TNFαml的保护率分别为8.7％，13.2％，20.4％，27.7％，34.6％；3) XERNTNFαml的保护率分别为15.1％，18.8％，21.2％，32.7％，38.5％；4) RNTNFαml的保护率分别为13.3％，18.6％，19.5％，24.3％，31.8％。中和试验后的滴度试验中，在各个剂量下，1) XETNFαml将病毒滴度由1：5120分别降至1：1280，1：320，1：160，1：40，1：20；2) CD4V1TNFαml将病毒滴度由1：5120分别降至1：1280，1：320，1：80，1：40，1：20；3) XERNTNFαml将病毒滴度由1：5120分别降至1：1280，1：640，1：160，1：160，1：40；4) RNTNFαml将病毒滴度由1：5120分别降至1：2560，1：640，1：160，1：40，1：40。随着药物剂量的增加，病毒滴度也逐渐下降，药物剂量与病毒滴度的下降之间有良好的剂量—效应关系。第二部分：TNFαm2类靶向性融合蛋白的研究作为效应分子的TNFαm2由天然TNFαN-端缺失突变掉7个氨基酸，并将第Pro8Ser9Asp10替代为Arg8Lys9Arg10。与野生型TNFα相比，TNFαm2的杀伤活性提高了2.5倍，毒性降低了18倍。该高效低毒突变体TNFαm2已应用于临床。利用基因重组技术，将XE，CD4V1，以及XERN的C端分别与TNFαm2的N端融合获得三种融合基因XETNFαm2，CD4V1 TNFαm2，以及XERN TNFαm2。将表达重组质粒分别转化入表达宿主菌DH5α及BL21，通过SDS-PAGE筛选获得高表达菌株pCW-XETNFαm2／DH5α、pET30a-CD4V1TNFαm2／BL21、pET30a-XERNTNFαm2／BL21。分别通过温度诱导及IPTG诱导，经激光密度扫描，其表达蛋白在总蛋白中的含量分别为38.6％，21.2％，24.5％。通过SDS-PAGE和切胶回收纯化融合蛋白CD4V1TNFαm2和XERNTNFαm2，经（?）KTA系统RHPLC柱纯化制备融合蛋白XETNFαm2。氨基酸序列分析N端15个氨基酸为MNVSEADDRYIXDRF，与预测一致。串连质谱分析鉴定出相关蛋白为人属的肿瘤坏死因子，并测定其分子量为17.4KD，等电点为8.6。用上述三种融合蛋白处理被SIV感染的CEMx-174细胞。杀伤试验中，设立被SIV感染的CEMx-174细胞为对照，同时设立融合蛋白作用于正常CEMx-174细胞的安全性对照和TNFα作用于SIV感染细胞的对照；中和试验中，设立被SIV感染的CEMx-174细胞为对照。均以2.0×10⁵／ml数量的CEMx-174细胞作为试验对象。结果显示：（1）杀伤试验中，三种融合蛋白实验组OD值均显著低于对照组（p＜0.05），并有良好的剂量—效应关系。1)在1，2，4，8，16μg／ml剂量范围内，XETNFαm2的杀伤率分别为21.0％，30.0％，37.6％，49.8％，65.3％；2)在2，4，8，16，32μg／ml剂量范围内，CD4V1TNFαm2的杀伤率分别为26.9％，31.6％，40.0％，44.7％，53.6％；3) XERNTNFαm2的杀伤率分别为18.7％，29.6％，33.5％，40.2％，49.7％。TNFα蛋白1，2，4，8，16，32在μg／ml剂量下对感染SIV的CEMx-174细胞生长情况无影响（P＞0.20）。同时，三种融合蛋白各自在杀伤试验的作用剂量下作用于未感染SIV的CEMx-174细胞，其细胞的生长情况和正常细胞的生长情况无统计学意义的差异（p＞0.20）。证实了靶向性融合蛋白的特异性靶向杀伤作用，符合试验设计的要求。滴度试验中，1)在1，2，4，8，16μg／ml剂量范围内，XETNFαm2将病毒滴度由1：5120分别降至1：1280，1：640，1：80，1：40，1：20。2)在2，4，8，16，32μg／ml剂量范围内，CD4V1TNFαm2将病毒滴度由1：5120分别降至1：1280，1：640，1：320，1：40，1：40；3) XERNTNFαm2将病毒滴度由1：5120分别降至1：2560，1：640，1：160，1：40，1：20。随着药物剂量的增加，病毒滴度也逐渐下降，药物剂量与病毒滴度的下降之间有良好的剂量—效应关系。（2）中和试验中，三种融合蛋白实验组OD值均显著高于对照组（p＜0.05），并有良好的剂量—效应关系。1)在1，2，4，8，16μg／ml剂量范围内，XETNFαm2的保护率分别为13.6％，18.9％，29.1％，38.0％，50.4％。2) 2，4，8，16，32μg／ml剂量范围内CD4V1TNFαm2的保护率分别为8.6％，15.7％，23.6％，30.5％，42.0％；3) XERNTNFαm2的保护率分别为7.3％，21.3％，28.6％，34.7％，39.6％中和试验后的滴度试验中，在各自的剂量范围内，1) XETNFαm2将病毒滴度由1：5120分别降至1：1280，1：640，1：160，1：40，1：20；2) D4V1TNFαm2将病毒滴度由1：5120分别降至1：1280，1：320，1：80，1：40，1：20；3) XERNTNFαm2将病毒滴度由1：5120分别降至1：2560，1：1280，1：320，1：160，1：20。随着药物剂量的增加，病毒滴度也逐渐下降，药物剂量与病毒滴度的下降之间有良好的剂量—效应关系。另外，利用FACS测定细胞凋亡，验证融合蛋白的作用机理。杀伤试验中，细胞凋亡率如下：对照组21.2％；16μg／ml的剂量下，XETNFαm2作用组为47.1％，TNFαm2作用组为20.8％。中和试验中，对照组20.3％，XETNFαm2作用组为11.3％。初步证实XETNFαm2可特异性地引发HIV／SIV感染细胞的凋亡，同时保护正常细胞。第三部分：HP靶向性融合蛋白的研究除了以上思路，在本课题中还将含有穿孔素N端活性域的104个氨基酸的C端与XE的N端融合获得融合蛋白HP₁₀₄XE。穿孔素可以在细胞膜上形成一个跨膜通道，使细胞的通透性增加而发生渗透性溶解。将表达重组体分别转化JM109和BL21得到高表达菌株pGEX4T1-P312XE／JM109和pET32a-P312XE／BL21，IPTG诱导后蛋白表达量分别占细胞总蛋白的有10.5％和37.6％。但由于仅获得融合表达，考虑到后续的蛋白纯化工作有一定困难，没有继续深入研究。细胞试验结果显示，融合蛋白既可以有效杀灭受HIV／SIV病毒感染细胞，又可以通过中和血循环中游离的HIV／SIV病毒，阻止其对正常细胞的感染，保护正常组织细胞。本研究为研制一类高效安全的治疗艾滋病的基因工程活性多肽药物进行了有益的探索。该研究尚待深入与发展。但其设计思路对于研制靶向性治疗艾滋病、肿瘤和自身免疫性疾病等活性多肽药物的设计，均可资参考。