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胚胎干(Embryonic Stem，ES)细胞是全能性干细胞的典型代表，其心肌分化过程可以用来研究心肌发育过程，而其分化而来的心肌细胞可以作为细胞治疗的供体或作为药物筛选平台。近年来，一氧化氮(Nitric Oxide，NO)作为一种气体信号分子，成为基础生物学、生物医学及转化医学领域的明星分子，在逐步揭开其生理作用的同时，围绕其进行的临床研究也取得了丰硕的成果，开发出了多种药物和治疗方法，为人类健康做出了重要贡献。由于在几乎所有人体组织中都有NO合酶(NOS)的表达，而且NO在干细胞增殖分化、表观遗传学调控和免疫反应等方面都发挥重要作用，所以NO必然和干细胞基础研究及临床应用有着密切的相关性。本研究论证了NO供体S-亚硝基谷胱甘肽(S-Nitrosoglutathione，GSNO)短时间处理可以通过亚硝基化作用促进心肌分化。 亚硝基化修饰是指NO基团与蛋白质巯基，尤其是半胱氨酸上活性巯基的结合，可以发挥多种生物学功能，如调节蛋白质稳定性、反应活性，干扰蛋白质间相互结合以及细胞内定位，甚至与其他种类翻译后修饰竞争等。GSNO作为体内广泛存在的亚硝基硫醇类NO供体，是NO在体内的主要承载体，也是细胞内蛋白质亚硝基化修饰功能的主要承担者。在心脏中，GSNO是一种内源性保护性物质并且可以对多种蛋白进行亚硝基化修饰，对于心肌组织中多种离子通道、酶类发挥正常功能，维持心肌细胞内氧还平衡等至关重要。那么，研究GSNO在干细胞心肌发生中的作用有着非常重要的价值，将有可能对再生医学和心肌修复领域提供有意义的参考。至今为止，绝大多数关于NO在干细胞生物学方面的研究集中于sGC/cGMP途径，而忽视了对蛋白亚硝基化可能发挥的作用。亚硝基化修饰靶点多样，功能各异，在干细胞心肌分化过程中可以发挥何种作用值得探究。 在本研究中，发现短时间GSNO处理ES细胞衍生的拟胚体(Embryoid Body,EB)可以提高心肌细胞分化率，并阐明亚硝基化在这一过程中发挥的关键作用。通过定量亚硝基化蛋白组学和生物信息学分析，发现Prdx-2的亚硝基化可以导致过氧化氢(H2O2)积聚并启动X-box binding protein-1s/PI3K/AKT信号通路，最终促进了心肌细胞的分化。这些发现对干细胞分化的调控提供了新的认识，并对再生医学和诱导多能干(iPS)细胞治疗提供了有益的借鉴。 一.S-亚硝基谷胱甘肽促胚胎干细胞心肌分化及亚硝基化蛋白组学 目的:探索GSNO对小鼠ES细胞心肌分化的影响，同时论证GSNO起作用的方式。 方法和结果:采用悬滴、悬浮、贴壁三步法诱导心肌分化体系，在形成EBs后，对EBs进行2h的GSNO处理，然后继续贴壁培养并考察心肌分化情况。结果发现，25μM GSNO处理可以显著提高贴壁培养3d后EBs搏动率和心肌特异蛋白α-actinin表达，免疫荧光也显示GSNO可以诱导形成结构完整的肌小节结构。通过亚硝基化还原剂DTT、sGC抑制剂ODQ和GSNO合用，发现DTT可以拮抗GSNO的促心肌分化作用，而ODQ不能拮抗，说明GSNO的促分化作用是依赖于其亚硝基化作用。继而采用氨基酸稳定同位素标记(Stable Isotope Labeling withAmino Acidsin Cell Cultures，SILAC)法对细胞进行同位素标记，然后在GSNO处理后提取亚硝基化蛋白，通过质谱检测GSNO处理导致亚硝基化蛋白靶点并定量分析亚硝基化程度，通过生物信息学分析对亚硝基化蛋白进行分类。GSNO处理后，发现104个亚硝基化上调蛋白，其中既具有酶活性又与氧还平衡密切相关的Prdx家族1和2型蛋白亚硝基化分别上升2.66和3.06倍，是被亚硝基化程度较高的蛋白。 结论:GSNO可通过蛋白质亚硝基化作用促进心肌分化，明确了104个蛋白亚硝基化靶点，通过蛋白功能分类，选择亚硝基化修饰程度高，同时既具有酶活性又与氧还平衡密切相关的Prdx-1，2为后续论证的候选靶蛋白。 二.Peroxiredoxin-2亚硝基化促进心肌分化机制研究 目的:探索Prdx-2亚硝基化在GSNO促心肌分化中的作用 方法和结果:首先对质谱结果进行免疫印迹确认，发现相对于Prdx-1，Prdx-2是拟胚体时期高表达的Prdx类型;继而考察GSNO处理后，Prdx-2底物过氧化氢(H2O2)含量变化情况，发现GSNO处理后，EB内H2O2积聚，而前体超氧阴离子(O2·-)并没有增加。同时发现p38 MAPK并没有被GSNO激活，而PI3K/Akt信号通路被激活。通过对PI3K不同亚基的检测，发现p-p85 PI3K亚基在GSNO处理后，在胞浆胞核的含量发生变化，更多地聚集在胞浆中，同时与p110 PI3K亚基结合上升，激活PI3K通路。对p85 PI3K亚基入核分子伴侣XBP-1s检测发现GSNO和H2O2处理均不影响其表达和细胞内定位，然而对其和p-p85 PI3K亚基的结合有下调作用。干扰XBP-1s表达可以激活PI3K/Akt信号通路，并促进ES细胞心肌分化。 结论:GSNO致Prdx-2亚硝基化可抑制Prdx-2催化H2O2降解，使细胞内特定区域H2O2积聚，通过减弱XBP-1s和p-p85 PI3K亚基的结合，激活PI3K/Akt信号通路，促进ES细胞心肌分化。