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RyhB是一种大小为90bp左右的细菌非编码小RNA,可在转录后水平调节基因的表达。前人研究表明存在于鼠伤寒沙门氏菌和霍乱弧菌中的两种RyhB同源物RyhB-1与IsrE可调控细菌生物膜形成、趋化性和耐酸性。本研究对肠炎沙门氏菌sRNA RyhB两种同源物RyhB-1与IsrE在肠炎沙门氏菌致病性上的作用,以及两种同源物能否对毒力调控发挥协同作用进行了如下的研究。1肠炎沙门氏菌50336 RyhB-1与IsrE在不同环境下表达量检测根据肠炎沙门氏菌RyhB-1与IsrE序列设计引物,利用荧光定量PCR反应检测二者在肠炎沙门氏菌不同生长时期时处于铁匮乏、模拟肠道环境、感染巨噬细胞的培养条件下的表达量,分析RyhB-1与IsrE在不同培养时期和不同培养条件时表达量的变化规律尤其是模拟宿主内环境时表达情况,结果显示,在铁匮乏条件下,对数期时,RyhB-1与IsrE的表达水平均比普通LB培养时高2倍,稳定期时,RyhB-1与IsrE的表达量分别是普通LB培养条件下的2.5倍和3倍,表明两种sRNA表达量的升高与该菌在缺铁环境中需要高效吸收铁有关,推测两种sRNA可调控铁代谢。模拟肠道环境下,对数期时RyhB-1与IsrE的表达水平与普通LB培养时相比,分别上升3.5倍和3倍,稳定期时上升1.3倍和1.5倍。与感染巨噬细胞前相比,感染1h和4h时,RyhB-1的表达水平分别上升2倍与5.5倍,IsrE的表达水平分别上升4.5倍与8.5倍。表明了RyhB-1与IsrE在受到环境变化压力下被诱导表达使表达量显著升高,IsrE的表达水平变化高于RyhB-1,推测二者均与肠炎沙门氏菌的毒力相关,但对毒力的调控方式可能不同。2肠炎沙门氏菌50336 RyhB-1与IsrE双缺失突变株及相应回补株构建本课题前期利用λ-Red同源重组系统构建了ryhB-1和isrE单基因缺失株,本研究将继续利用同源重组系统构建出ryhB-1和isr E双基因缺失株,在此基础上,分别设计含有ryhB-1和isrE序列和上下游非编码序列以及酶切位点的引物,利用pBR322表达质粒构建isrE单缺失株的回补株50336△isrE/pisrE,利用pACYC184表达质粒构建ryhB-1单缺失株的回补株50336△ryhB-1/pryhB-1,利用pBR322表达质粒和pACYC184表达质粒构建ryhB-1和isrE双缺失株的回补株50336△ryhB-1/△isrE/pryhB-1/pisrE,为进一步探索sRNA RyhB的两种同源物ryhB-1和isrE在肠炎沙门氏菌致病过程中的作用提供材料。3体内外实验分析肠炎沙门氏菌50336 RyhB-1与IsrE在致病性方面的作用通过肠炎沙门氏菌野生株50336、ryhB-1和isrE单双基因缺失株以及相应的回补株检测细菌的运动能力、生物膜形成能力、对各运动性关键基因表达量、对宿主细胞的侵袭力和黏附力、对巨噬细胞的抗吞噬力与在巨噬细胞内的存活率、对易感动物1日龄雏鸡的半数致死量,死亡率,体内细菌分布,分析RyhB-1与IsrE在调控毒力与致病性上的差异性,结果显示ryhB-1或isrE单一基因的缺失会下调这些能力,毒力减弱；ryhB-1和isrE双基因的缺失对这些能力的下调更为明显,毒力下降更为显著,表明两种sRNA均对肠炎沙门氏菌致病性具有增强作用。