海葵溶细胞素(actinoporin)是一类分子量在20kDa 左右，对膜上鞘磷脂有特异性作用的一类的蛋白家族。目前，已经从30多种海葵中分离鉴定了多种溶细胞素。有毒海葵蛰伤是一种常见的海洋生物伤，因此，分离、提取和鉴定我国沿海代表性有毒海葵毒素，并深入研究其生物活性，不仅可以获得具有生物活性的有效成分，还可以为海葵蜇伤的针对性有效防护与治疗策略提供理论依据，并可能为新药研制提供重要的研究思路及治疗靶点。本课题选择我国南海代表性的有毒海葵—巨形列指海葵（Stichodactyla gigantea）为研究对象，主要研究内容及结果如下：1. 海葵溶细胞素Gigantoxin-4的分离与鉴定。首先，提取新鲜触手组织中的粗毒组分，建立了相对特异的蛋白双向电泳谱图。然后采用快速蛋白液相色谱技术(FPLC)分离其中的具有溶血活性的组分，先用Hitrap Capto S 阳离子交换色谱获得了两个具有溶血活性的组分，接着用Superdex 75 prep grade 凝胶色谱进一步纯化前面得到的活性组分，结果获得两个分子量19 kDa 左右的纯度较高的溶血活性组分。将其中一个纯度较高的活性组分进行质谱分析和N 端部分氨基酸序列测定，结果表明得到的部分序列与已报道的几种海葵溶细胞素如Cytolysin-3(HMg III)、RTX-A、Sticholysin-1(StI)、Sticholysin-2(St II)有较高的同源性，等电点为9.3，我们将这个蛋白命名为Gigantoxin-4。2. Gigantoxin-4的溶血活性及影响因素分析。Gigantoxin-4 具有很强的溶血活性，浓度为40ng/mL时，即可引起50％的红细胞溶血，通过激光共聚焦显微镜观察发现该毒素可以导致红细胞变形甚至破碎。我们还探讨了温度、pH、室温放置时间、冻融次数、金属离子等理化因素对其溶血活性的影响，确定Gigantoxin-4溶血活性的最适条件是pH 7.4、37℃条件下反应30～40min，高温、强酸碱、反复冻融和室温放置过久都会降低Gigantoxin-4溶血活性。不同的金属离子对Gigantoxin-4的溶血活性有不同的影响，Mg2+、K+能够促进Gigantoxin-4的溶血活性，且K+的促进作用比Mg2+强，Ca2+、Ba2+、Mn2+、Cu2+和Zn2+等金属离子能不同程度地抑制Gigantoxin-4的溶血活性。我们还研究了不同磷脂组成的小单层囊膜脂质体(SUV)对海葵溶细胞素Gigantoxin-4溶血活性的影响。结果表明，Gigantoxin-4能与SM、SM:PC(1:1)、SM:Cho(1:1)及SM:PC:Cho(1:1:1)构成的脂质体相互作用， 从而竞争性地抑制了Gigantoxin-4的溶血活性。3. Gigantoxin-4的生物学活性研究。我们以不同磷脂组成的包裹钙黄绿素的大单层囊膜脂质体(LUV)为模型研究Gigantoxin-4对LUV的透性作用，结果与第二部分SUV对Gigantoxin-4溶血抑制作用的实验结果基本一致，膜上的鞘磷脂的存在对于Gigantoxin-4 发挥作用有着重要的意义，而胆固醇的存在更有利于Gigantoxin-4和鞘磷脂的结合。我们还发现海葵溶细胞素Gigantoxin-4 具有类似于鞘磷脂酶的活性，能够水解特异性的底物TNPAL-SM，但该结论还需进一步的实验来证实。采用MTT 法检测Gigantoxin-4的细胞毒作用，结果表明其对肿瘤细胞MCF-7、SW-1990等均有杀伤作用，IC50分别为1.71和1.32 μg/mL。流式细胞仪对细胞凋亡的检测结果表明，1μg/mL Gigantoxin-4几乎不诱导MCF-7细胞的凋亡，以坏死为主。对小鼠尾静脉注射Gigantoxin-4的急性毒性试验发现Gigantoxin-4的半数致死量约为73.6 μg/kg，且毒性效应快速、剧烈。通过股静脉给予大鼠注射Gigantoxin-4，在60μg/kg 剂量下，15 min内会导致大鼠呼吸衰竭而死亡，组织病理切片结果证实肺部是损伤最严重的脏器；在30μg/kg 剂量下，大鼠可以存活几个小时，最终还是会死于心脏和呼吸衰竭。血清生化检测结果表明静脉注射Gigantoxin-4 (30μg/kg)后，肝脏和心脏损伤相关的酶如ALT、AST、LDH、CK、CK-MB等都有显著的升高。综上实验结果，得出以下结论：我们从海葵Stichodactyla gigantea的触手组织中分离纯化出一种19 kDa 左右的溶细胞素Gigantoxin-4，等电点约为9.3，通过N 端序列测定及LC-MS 鉴定了其N 端氨基酸序列及部分其他序列，比对结果显示，与HMgIII、RTX-A、St I、St II等有较高的同源性；本实验还从分子水平、细胞水平以及整体动物水平对Gigantoxin-4的生物学活性进行了研究，发现该毒素具有很强的溶血活性和细胞毒作用，并有一定类似鞘磷脂酶的活性，静脉注射大鼠能导致以肺和心脏为主的各个脏器的损伤、衰竭；此外，通过显微观察、脂质体模型、流式细胞术等方法对其活性进行了初步的机理探讨，证实该毒素能与膜上的鞘磷脂结合，形成孔洞或使其降解，从而导致膜的变形破碎。随着对海洋资源的日益关注，新发现的海葵溶细胞素会不断增多，对海葵溶细胞素的结构和功能研究也将不断深入。对海葵毒素广泛而深入的研究有助于合理而充分的利用我国丰富的海葵资源，对新药研制以及海葵蛰伤的救治措施都具有重要意义。