近年发现细菌和古细菌中广泛存在规律成簇间隔的短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）与CRISPR相关蛋白基因（CRISPR-associated）组成的CRISPR/Cas系统，该系统能够有效地防御外源基因元件的入侵，限制基因的水平转移（horizontal gene transfer，HGT）。但在食源性致病菌中发现 CRISPR系统除了免疫防御功能以外，还可能具有调节细菌毒力等的其他功能。并且食源性致病菌的CRISPR系统呈现出的多样性在不同菌株之间存在差异，这种差异为食源性致病菌的遗传进化、分子分型提供了更为可靠的依据。CRISPR系统不仅应用于研究细菌分型，其独特的作用原理还被应用于基因编辑，成为一种新兴的、广泛的应用于原核生物及真核生物中的基因组编辑工具，为研究功能基因及基因间的相互作用提供了更为高效、精准的手段。本课题将CRISPR系统的两大功能应用于副溶血性弧菌中，通过检测副溶血性弧菌中的CRISPR系统对副溶血性弧菌进行分子分型与进化分析，并且首次采用CRISPR/Cas9技术对副溶血性弧菌进行基因编辑，构建新型的应用于副溶血性弧菌的基因组编辑工具。　　1.副溶血性弧菌CRISPR的检测及其结构分析　　本章检测了79株副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus，简称VP)中的CRISPR位点，并对不同来源的VP中CRISPR位点的结构多样性进行分析。根据CRISPR DB数据库中公布的VP中确定的CRISPR结构序列CRISPR-1及文献中新发现的疑似CRISPR结构序列CRISPR-2设计引物，对不同来源的79株VP进行PCR扩增。利用CRISPR Finder分析CRISPR结构，采用生物信息学方法对不同来源的VP的CRISPR位点结构多样性进行比较分析。结果发现79株VP中CRISPR-1的检出率为92.41％，CRISPR-2的检出率为96.20%，同时具有这2个位点的菌株占总数的89.87%，只有1株菌被检出不含有任何位点。分别比较不同来源的菌株CRISPR-1、CRISPR-2位点的重复序列发现，不存在序列差异，而临床菌株的这2个CRISPR位点在间隔序列上比环境分离菌株存在更多的变异。2个CRISPR位点根据间隔序列的不同在VP中一共组成8种CRISPR谱型（编号A-H），除F谱型外，A-E、G谱型均只在临床分离菌株中发现，而在环境分离菌中还发现不含任何位点的H型。总之，CRISPR在VP中普遍存在并且环境分离菌株与临床分离菌株的CRISPR结构存在差异。　　2. CRISPR/Cas9基因编辑技术在大肠杆菌中的应用研究　　CRISPR/Cas9技术作为一种新兴的基因编辑技术被广泛的应用于原核生物、真核生物的基因组编辑中，该技术的优势在于高效、精准的对基因组进行定点修饰。本章利用CRISPR/Cas9技术对模式生物大肠杆菌进行快速、高效的基因编辑，旨在摸清CRISPR/Cas9技术在细菌中应用的操作流程，为后续实验打下基础。通过利用双质粒系统将CRISPR/Cas9与λ-Red重组系统相结合，融合PCR构建同源重组模板，以电转化的方式导入Escherichia coliMG1655中，并对其qseB基因进行快速编辑，通过表型及测序验证基因是否敲除成功。结果表明敲除qseB基因后的菌株运动性增强，并且通过表型、菌落 PCR及测序验证ΔqseB突变株构建成功。CRISPR/Cas9偶联λ-Red重组技术更进一步提高了编辑效率，缩短了实验周期，为后续该技术在副溶血性弧菌中的应用打下基础。　　3. CRISPR/Cas9基因组编辑技术在副溶血性弧菌中的应用研究　　本章首次利用 CRISPR/Cas9技术对 VP基因组进行编辑修饰，初步探究该技术在VP中的应用情况。本章选取VP QS系统中的两个关键基因aphA、opaR进行实验，这两个基因的缺失会造成细菌被膜发生变化，便于从表型中观察基因敲除情况。利用CRISPR/Cas9与λ-Red重组技术相结合的双质粒，通过融合PCR的方法构建上述两基因的同源重组模板，构建插入重组模板的质粒 pTargetT-aphA、pTargetT-opaR及不插入同源重组模板的质粒pTargetF-aphA、pTargetF-opaR，将质粒分别导入VP31中，结果未得到含有双质粒的转化子，但在VP31中只能获得带有其中一种质粒的转化子，说明质粒在VP中具有不相容性。为了解决这一技术问题，将对宿主菌VP进行质粒消除，并改造现有质粒，实现该技术在VP中的应用。　　本课题的研究为探究VP自身CRISPR/Cas系统功能及构建新型的应用于VP中的基因编辑工具提供了一定的实验基础。