论文部分内容阅读
小分子（small molecules,SMs）组合使成纤维细胞（fibroblasts,FBs）绕过中间阶段直接重编程为诱导性神经元（induced neuron cells,iNs）的研究成果,极大地推动了再生医学研究的进步。但是,综合现有研究结果,FBs体外重编程获得神经元的效率、质量和数量与后续的基础研究及实际应用的差距,仍然是该领域亟待解决的科学和技术问题。机体内组织细胞结构和功能的维持、增殖和分化的调控依赖于细胞赖以生存的微环境,虽然物理信号和miRNA对FBs直接重编程为iNs的影响已有陆续报道,但其调节神经元重编程的分子机制尚未有系统性解读,而且物理因素并未涵盖细胞外基质（extracellular matrix,ECM）的全部特性。目前神经诱导体外研究主要使用刚性聚苯乙烯组织培养皿（tissue culture plate,TCP）（～GPa）,仅就其硬度而言TCP与体内ECM也有很大的区别。已知脑组织的硬度是在100Pa-3kPa的范围内较软的硬度,这种硬度对神经元直接重编程的影响虽尚未见详尽解析,但较软ECM硬度可以诱导多种干细胞向神经方向分化,并证明有Hippo、细胞骨架以及整合素（如整合素亚基beta 1和整合素亚基beta 4（integrin beta 4,ITGB4）等）等多种关键物理信号参与,但力学信号与miRNA之间的相互调控关系亦未见相关报道,包括参与神经分化的miR-615-3p。因此,在SMs组合神经直接重编程研究的基础上,探索miRNA与力学信号对神经元重编程的影响及作用机制具有重要科学意义和应用价值。本研究:（1）以人包皮成纤维细胞（human foreskin fibroblasts,hFFs）为起始细胞,以具有电生理特性的神经元为目的细胞,利用Ⅰ型胶原制备软基质并通过纳米压痕仪检测软基质的弹性模量范围,通过形态学统计、定量逆转录PCR（quantitative reverse transcription PCR,qRT-PCR）、免疫荧光和膜片钳等技术方法,探究软基质对SMs组合神经直接重编程的影响;（2）对重编程过程中的TCP上的 hFFs（hFFs on TCP,ThFFs）、软基质上的 hFFs（hFFs on soft substrates,SShFFs）、TCP 上的 iNs（iNs on TCP,TiNs）和软基质上的 iNs（iNs on soft substrates,SSiNs）进行转录组测序,通过差异表达（differentially expressed,DE）GO和KEGG分析其中的神经发育相关信号和力学信号,并利用透射电镜和免疫荧光技术对力学信号通路进行验证,对全转录组测序数据进行竞争性内源RNA（competing endogenous RNA,ceRNA）网络分析软基质促进神经元重编程的miRNA靶向mRNA力学信号的调控机制,结合力学信号通路锁定miRNA-mRNA研究目标;（3）利用双萤光素酶报告、细胞转染、qRT-PCR和Western Blot等实验对锁定的miR-615-3p/ITGB4信号轴在重编程过程中所起的作用及机制进行探讨,为以神经修复为基础的再生医学提出新的思路和理论基础。1.软基质促hFFs重编程为具有电生理功能的谷氨酸能神经元成功分离与培养原代hFFs,它们表达VIMENTIN,不表达E-CADHERIN,是不具有多向分化潜能的间质细胞,符合神经元重编程起始细胞的要求;利用Ⅰ型胶原制备的软基质的弹性模量范围在450-850Pa之间,聚集在600Pa左右,符合脑组织和神经分化的硬度范围,且其在重编程过程中不会完全降解;经过观察和统计发现,软基质显著提高神经样形态细胞和突起的数目;同时也发现软基质促进直接重编程过程中间质-上皮转化（mesenchymal-epithelial transition,MET）的发生;对神经元重编程阶段进行探索,在第4天TiNs不能增殖,而SSiNs可以,因此,有必要在后续过程中确定此时神经干细胞（neural stem cells,NSCs）的存在,在第7天和第10天,SSiNs处于非增殖阶段;软基质还能抑制FBs标志物VIMENTIN、CTGF、COL1A1和DKK3的表达,同时提高神经标志物神经元 Ⅲ类 β-微管蛋白（neuronal class Ⅲ β-tubulin,TUJ1）、ASCL1、微管相关蛋白2、TAU、NEUN、SYN1、Nav1.3和Kv4.3的表达,重要的是,软基质使得突触前蛋白SYN1、突触后蛋白PSD95和囊泡谷氨酸转运蛋白1（type Ⅰvesicular glutamate transporter,vGLUT1）表达提高,尤其是在突起处,阳性细胞数量明显增加,说明软基质对iNs的突触网络形成以及vGLUT1的表达都很有利。另外,软基质降低iNs的静息膜电位,提高Na向内最大电流,促进快Na+向内电流和动作电位的发生;通过对重编程过程中NSCs标志物NESTIN和PAX6的表达以及成球能力判断,没有发现可以形成球体的去分化的NSCs中间体。这些结果表明450-850Pa的软基质促进人FBs直接重编程为具有电生理功能的谷氨酸能神经元。2.软基质在神经元重编程中的miRNA与力学信号机制对SShFF与ThFFs之间、SSiNs与TiNs之间和两组共同DE RNAs之间进行DE分析,发现软基质促进神经发育,表现在神经凸起发育、神经元胞体、轴突、突触、谷氨酸代谢、轴突引导等,进一步说明了软基质促进谷氨酸能神经元的生成,同时发现软基质促进神经元重编程的一些机械线索,如粘着斑,应力纤维、微管结合、肌动蛋白丝结合、整合素结合、河马信号通路、肌动蛋白细胞骨架的调节和间质上皮转化等。单独对显著富集的Hippo和细胞骨架信号通路分析也证实,这两个通路存在多个DE转录本富集;对各组进行透射电镜观察发现微丝减少并从聚集在细胞核的周围变为分散分布于细胞质中。通过对Yes相关蛋白（Yes-associated protein,YAP）进行核定位统计发现,软基质促进神经元重编程过程中YAP的出核。ceRNA网络分析后,将其中的mRNA与细胞骨架和Hippo信号通路中的基因取交集,锁定了 ITGB4及其上游miR-615-3p,经qRT-PCR证实,软基质抑制miR-615-3p的表达,并促进ITGB4的表达,两者在软基质上的表达趋势相反。这些结果表明软基质可能通过影响细胞骨架和Hippo信号通路来促进神经元重编程,同时miR-615-3p与ITGB4可作为继续研究的神经元重编程靶点。3.软基质通过抑制miR-615-3p靶向ITGB4促进神经元重编程miR-615-3p和ITGB4具有序列互补结合位点,双萤光素酶报告提示miR-615-3p与ITGB4可能结构互作,并且过表达或抑制miR-615-3p后,分别可以降低或升高ITGB4在RNA和蛋白水平上的表达,基于此,我们探究了 miR-615-3p抑制是否可以提高神经标志物的表达,miR-615-3p的过表达是否可以逆转软基质的促神经元重编程作用,结果发现,抑制miR-615-3p可以提高ThFFs中TUJ1和ASCL1的表达以及TiNs中TUJ1和TAU的表达,过表达miR-615-3p可以降低SSiNs的TAU和ASCL1的表达,说明软基质可以通过抑制miR-615-3p来促进神经元重编程。成功构建过表达和敲降ITGB4的hFFs稳转细胞系后,将其进行神经元重编程,结果表明,ITGB4过表达可以增加ThFFs中TUJ1和ASCL1以及TiNs中TUJ1和TAU的表达,而ITGB4敲低可以降低SSiNs中TUJ1、ASCL1和TAU的表达,说明软基质可以通过过表达ITGB4来促进神经元重编程。更重要的是,在ITGB4过表达的基础上进一步过表达miR-615-3p,以及在ITGB4敲降的基础上进一步抑制miR-615-3p,发现miR-615-3p可以回复ITGB4对神经重编程中神经标志物表达的影响,这表明,miR-615-3p与ITGB4之间存在靶向关系,并且,软基质很可能是通过抑制miR-615-3p靶向ITGB4来促进神经元重编程。综上所述,我们首次表明了 450-850Pa软基质显著提高iNs的产生效率和质量,在重编程过程中无需与神经胶质细胞共培养,促进MET过程,在更短的时间内产生更多具有电生理功能的谷氨酸能神经元。测序数据分析表明,软基质可能通过影响肌动蛋白细胞骨架、Hippo信号通路和整合素等力学信号以促进谷氨酸能神经元重编程,同时竞争性内源性RNA网络与力学信号的联合分析为神经元重编程提供了新的目标,即ITGB4与miR-615-3p,在此基础上我们首次证明了 miR-615-3p与ITGB4存在靶向关系,软基质很可能通过抑制miR-615-3p靶向ITGB4,进而影响细胞骨架来促进神经元重编程。神经元重编程效率与质量的提高将为再生医学后续的基础与临床研究提供足够数量的功能性神经元,为进一步揭示软基质提高重编程效率的机制提供新的见解,对神经再生为目的的医用生物材料的设计提供了新的思路。