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研究目的阻塞性黄疸（obstructive jaundice,OJ）是一种由于胆道、胰头病变,引起肝内或者肝外胆管发生阻塞,导致胆汁排出不畅、淤积反流所引发的一种临床症状。该患者通常存在不同程度的心血管功能损害,手术麻醉中通常表现为患者血压偏低以及对血管活性药物反应性减弱,称为阻塞性黄疸的血管低反应。对于血管反应性的研究已超过半个世纪,其中血管内皮细胞的活性及通透性改变的调节机制受到大量的研究关注。然而,胆汁淤积患者出现心血管反应性受损的病因机制仍然不确定。据报道,瞬时受体电位阳离子通道V4（TRPV4）在心血管系统中,特别是在内皮细胞上广泛表达,并且其可以调节下游多种细胞因子释放与改变细胞对Ca2+离子的通透性,广泛参与到各种病理生理情况下心血管系统的调节。目前,尚无研究报道过阻塞性黄疸时,TRPV4通道蛋白在血管反应性的改变中是否发挥作用。本课题的目的是探索黄疸患者外周循环中增高的胆汁酸（Bile acids,BAs）通过调节大血管内皮细胞上的TRPV4通道蛋白表达,引起内皮细胞Ca2+离子内流、激活环氧合酶2（Cyclooxygenase 2,COX2）等改变,介导阻塞性黄疸的血管低反应性发生。研究方法1、通过大鼠胆管结扎术（bile duct ligation,BDL）创建阻塞性黄疸的实验动物模型。获取不同时间点的Sprague-Dawley（SD）模型大鼠胸主动脉段,并修剪至3-4毫米血管环,在血管张力仪下测得其血管张力与收缩力,对比分析。检测不同时间点胸主动脉血管中TRPV4蛋白及其mRNA表达情况。对张力仪下的血管使用TRPV4激动剂GSK1016790A,进一步分析、验证TRPV4筒灯蛋白表达与BDL时间、血管张力之间的相关性。2、检测BDL大鼠血清中胆汁主要成分胆汁酸、胆红素的水平。体外培养大鼠胸主动脉内皮细胞,分别向培养基中加入胆汁酸、胆红素,设置对照组加入等体积的培养基,共同培养细胞。通过测定不同因素刺激下内皮细胞内TRPV4蛋白、mRNA表达情况,以及观察TRPV4蛋白与内皮细胞质膜上的Dil蛋白免疫荧光共标情况,探究阻塞性黄疸时,影响TRPV4蛋白表达改变的主要原因,以及TRPV4蛋白的表达部位。3、在不同数量级的浓度梯度的血管活性药物乙酰胆碱和去甲肾上腺素的作用下,观察BDL大鼠胸主动脉血管环收缩、舒张状态,以及观察BDL模型动物同时给予TRPV4抑制剂HC-067047后血管收缩、舒张恢复情况,分析阻塞性黄疸血管活性药物低反应性的机制。进一步探索TRPV4蛋白激活后的下游机制,使用药物吲哚美辛、L-NAME和塞来昔布分别抑制非选择性环氧化酶（即COX）、一氧化氮合成酶（即NOS）和选择性环氧化酶COX2,观察大鼠胸主动脉环在不同浓度血管收缩药物作用下的收缩情况,并检测BDL、BDL同时给予HC-067047后下游COX蛋白、mRNA表达情况。结果1、通过观察判断模型创建成功,获取目标血管。在含有KCL（60mM）的收缩溶液中,大鼠胸主动脉环的收缩张力随着BDL时间呈递减趋势;胸主动脉环细胞中的TRPV4蛋白、mRNA表达呈时间依赖的递增趋势,均在第五天达到显著差异。使用TRPV4蛋白激动剂GSK1016790A,胸主动脉环的舒张程度呈药物浓度依赖性与模型创建时间依赖性的递增趋势。2、BDL模型大鼠血清中胆汁酸、胆红素水平在第三天后均明显增加并维持在较高水平。与对照组比较,胆汁酸培养基中的内皮细胞TRPV4蛋白与mRNA表达显著增加,而胆红素培养基中的内皮细胞TRPV4则无明显的改变。免疫荧光显示,TRPV4蛋白与内皮细胞质膜Dil蛋白完全共标。细胞内钙显示,胆汁酸培养基中的内皮细胞内钙离子集聚较为明显。3、大鼠胸主动脉环舒张程度随乙酰胆碱浓度增加呈明显递增趋势,使用HC-067047不能明显减低血管环扩张程度。血管环收缩程度亦随去甲肾上腺素的药物浓度呈递增趋势,使用HC-067047可以显著抑制剂血管收缩。针对TRPV4下游分子使用不同抑制剂,结果显示COX抑制剂对血管环收缩剂的血管收缩反应的逆转作用较为明显,NOS抑制剂L-NAME则不会对血管收缩产生影响。进一步实验发现,使用HC-067047可以显著降低COX2蛋白、mRNA的表达。结论本研究可得出如下结论:1、阻塞性黄疸TRPV4蛋白表达增高与血管反应性下降相关。BDL后大鼠血管环收缩张力下降;该下降程度与胸主动脉中的TRPV4蛋白升高趋势相符,提示二者可能存在相关性;药理学激活TRPV4蛋白后引起胸主动脉呈现药物浓度依赖性舒张反应,明确了TRPV4蛋白的过表达参与BDL大鼠胸主动脉收缩张力的调节。2、胆汁酸介导主动脉血管内皮细胞TRPV4蛋白表达增高。阻塞性黄疸时,个体外周血中胆汁酸、胆红素水平明显增高。细胞培养时加入胆汁酸刺激可以引起TRPV4的过表达,且这种现象在胆红素培养时不明显,提示胆汁酸是胆汁淤积时引起血管张力改变的关键分子TRPV4蛋白表达增高的主要成分。细胞内钙成像结果佐证了这一结论,并验证了胆汁酸或是TRPV4通道蛋白引起的内皮细胞钙离子内流的存在。3、TRPV4蛋白通过COX途径参与黄疸血管低反应性。阻塞性黄疸血管低反应性表现为对血管收缩剂与血管舒张剂的反应能力下降。TRPV4蛋白参与调控了血管低反应性表现为对血管收缩剂不敏感。下游分子筛选时发现,TRPV4-COX2途径可能发挥主要作用。