研究背景慢性肾脏病进展的共同通路是进展性肾小管间质纤维化。肾小管间质纤维化的组织病理学特征是与炎症细胞相关的间质基质的沉积、肾小管细胞的减少、成纤维细胞的聚积和小管周围微脉管系统的稀疏。细胞外基质的过度沉积,尤其是胶原纤维,是肾小管间质纤维化的最显著特征。尽管有许多导致纤维化的因子,包括多种细胞因子和激素/代谢及血流动力学因素,TGF-β1及其信号通路是肾脏纤维化的关键分子通路。活化的转化生长因子-β(TGF-β)与其受体结合,以自分泌和旁分泌的方式通过Smad依赖和非依赖性信号传导通路来发挥生物学及病理学作用。TGF-β1与其Ⅱ性受体(TβRⅡ)结合能激活TGF-βⅠ型受体(TβRⅠ)-激酶,导致Smad2和Smad3(两种受体相关性Smads (R-Smads))磷酸化。随后,磷酸化的Smad2和Smad3与相同的Smad4结合,形成Smad复合物,进而转位于细胞核中,调节目的基因的转录。多种促进纤维化的基因、如Ⅰ型胶原(collagen Ⅰ)、Ⅲ型胶原(collagenⅢ)和MMP-1的组织抑制剂(TIMP-1)均为TGF-β/Smad信号通路的下游,表明Smad3是纤维化中TGF-β/Smad信号通路关键介质。细胞对TGF-β反应是具有高度细胞类型特异性的。Smads的DNA结合亲和力相对较弱。因此,最终的转录结果决定于同其他转录因子、辅助激活剂和辅助抑制剂的相互作用。而且越来越多证据支持TGF-β也激活非smad信号通路：如Rac1、TAK1(TGF β相关激酶1)、ERK1/2(细胞外信号调节激酶)、p38MPAK、JNK、Wnt/β-catenin、ROS、NF-KB及Akt等多条信号通路。非经典信号通路可能以组织甚至细胞特异性方式与Smad信号通路相互影响。TGF-β可以通过由磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)-Rac1介导的信号通路增加Ⅰ型胶原的产生。TGF-p信号通路似乎是许多其他致纤维化因素效应直接或间接整合,进而汇聚成的共同信号通路。其中像血管紧张素Ⅱ和高糖,是TGF-β的上游诱导剂,而像结缔组织生长因子则是其下游效应剂。Rac1是小鸟甘三磷酸酶(小GTP酶)的Rho家族的成员之一。Rac1广泛表达,以两种构象状态存在,一种是失火的GDP结合形式,另一种是活化的GTP结合形式。在细胞外信号的作用下,Rac1通过鸟苷酸交换因子(GEFs)转变成其活化形式。而通过GTP酶激活蛋白转化为失活形式。研究发现在人的肾小管上皮细胞中TGF-β1可以通过活化Rac1增加Collagen Ⅰ的合成。另外,活化的Rac1还具有增加基质金属蛋白酶(MMPs)的合成和分泌、活化NF-κB以及促进β-catenin核转位的作用。而且,在缺氧环境下,活化的Rac1可以诱导细胞生成ROS。而ROS可以诱导致纤维化反应。特异性敲除成纤维细胞Rac1的小鼠的皮肤伤口闭合延迟,胶原合成及肌成纤维细胞形成减少。在Rac1敲除的成纤维细胞中α-SMA和Ⅰ型胶原mRNA表达下降。这表明Rac1与肾脏纤维化密切相关。DOCK180是一种进化上保守的蛋白,DOCK180与另一种进化上保守的蛋白—吞噬和细胞运动性蛋白1(ELMO1)形成复合物,作为Rac的GEF,特异性激活Rac,参与了细胞迁移和吞噬凋亡细胞过程中细胞骨架的改变。ELMO能通过避免DOCK180被泛素-蛋白酶体系统降解而大大地促进DOCK180蛋白在细胞内聚集。ELMO还能促进DOCK180与Rac在细胞膜上共定位,因而间接地增强Rac GEF的活性。ELMO1基因的单核苷酸多态性与2型糖尿病易于罹患糖尿病肾病有关。正常小鼠肾脏中,ELMO1主要在肾小管及肾小球上皮细胞弱表达。而糖尿病小鼠肾脏和慢性肾炎的大鼠模型的肾脏中则明显升高。高糖条件下培养的COS细胞中ELMO1的表达高于正常糖条件下表达。而过表达ELMO1的细胞中collagen Ⅰ和fibronectin基因表达与正常细胞相比也是升高的。而collagen Ⅰ是纤维化的重要指标,那么ELMO1是否在肾脏间质纤维化中发挥了作用呢?此外,上述研究也表明ELMO1介导了高糖诱导的collagen Ⅰ和fibronectin的表达。而Rac1作为ELMO1的直接下游,也介导了TGF-β1诱导的collagen Ⅰ的表达。而高糖是TGF-p的上游诱导剂,那么TGF-β1对Rac1的活化是否是通过ELMO1介导的呢?围绕上述问题,本研究选择大鼠单侧输尿管结扎(UUO)模型作为肾间质纤维化模型,观察ELMO1的表达及分布。并用NRK-52E作为肾小管上皮细胞模型,观察TGF-p刺激后,ELMO1的表达变化,并过表达及沉默ELMO1,进一步观察其对Rac1活性、collagen Ⅰ的影响。目的在于探讨ELMO1在肾间质纤维化中的作用及其可能机制,为临床治疗提供新的干预靶点。实验方法1.大鼠单侧输尿管梗阻(UUO)模型制作雄性SD大鼠24只,体重250-280g,假手术(Sham)组6只,UUO模型组18只。制作UUO模型制作,每日常规给予大鼠饲料和饮用水,术后3、7和14天模型组各处死6只,Sham组于第14天处死。取左侧肾脏的1/2用中性甲醛固定,脱水和石蜡包埋,做常规病理染色和免疫组化,1/2用液氮冷冻,转移至-80。C保存,备蛋白提取。2.大鼠肾组织中ELMO1、collagen Ⅰ、 α-SMA的蛋白表达水平Western blotting检测(?)sham组、UU03天、7天、14天组大鼠肾组织中ELMO1、 collagen Ⅰ、 α-SMA的蛋白表达水平。3.检测大鼠肾组织中ELMO1mRNA4.检测大鼠肾组织中ELMO1的表达和分布。免疫组化检测sham组、UU07天组大鼠肾组织中ELMO1的表达和分布5.细胞培养NRK52E细胞株培养于含10%胎牛血清的F12/DMEM培养基中,培养条件为37℃,95%空气,5%C02。6.TGF-β1对NRK52E细胞表达ELMO1mRNA的影响7.TGF-β1对NRK52E细胞表达ELMO1和collagen I的影响以适当比例接种于35mm细胞培养皿中,待细胞达到60%融合,换成无血清培养基,同步化24小时后一组细胞换成含0、1、2、5、10ng/ml TGF-β1的无血清培养基分别培养48小时。或10ng/ml TGF-β1的无血清培养基分别培养0、24、48、72小时Western Blotting检测ELMO1和collagen I。8.过表达ELMO1对于collagen I表达的影响NRK52E细胞以适当比例接种于35mm细胞培养皿中,待细胞达到60%融合,用OPTI-MEM稀释的空载体pcDNA3.1(N)或pcDNA3.1/ELMO1与lipofectamine2000(每个35mm的皿中pcDNA3.1/ELMO12μg,lipofectamine20005μl)混匀后,转染5个小时,吸取换成10%血清培养基培养18小时,静置12小时后,加入或不加入TGF-β110ng/ml刺激48小时。Western Blotting检测ELMO1、collagen Ⅰ的表达9.过表达ELMO1对于Rac1(?)舌性的影响NRK52E细胞以适当比例接种于35mm细胞培养皿中,待细胞达到60%融合,用OPTI-MEM稀释的空载体pcDNA3.1(N)或pcDNA3.1/ELMO1与lipofectamine2000(每个35mm的皿中pcDNA3.1/ELMO12μg,lipofectamine20005μl混匀后,转染5个小时,吸取换成10%血清培养基培养18小时,转染后48小时使用Western Blot检测检测Total Rac1,使用Pull down实验和Western Blot检测ATP-Rac1。8. ELMO1siRNA对于Rac1(?)舌性的影响NRK52E细胞以适当比例接种于35mm细胞培养皿中,待细胞达到60%融合,用OPTI-MEM稀释的NC siRNA或ELMO1siRNA与lipofectamine2000(每个35mm的皿中NC siRNA或ELMO1siRNA100pmol, lipofectamine20005μl)混匀后,转染5个小时,吸取换成10%血清培养基培养18小时,转染后48小时使用Western Blot检测检测Total Rac1,使用Pull down实验和VVestern Blot ATP-Rac1。9.统计学处理所有数据均代表3次以上重复实验的结果,以均数±标准差表示,所有统计分析由统计软件SPSS13.0完成。当方差齐时,多个样本均数的比较采用One-Way ANOVA,两两比较采用LSD,当方差不齐时使用Welch检验,两两比较采用Dennett’s T3。两样本均数比较采用t检验。P<0.05为差异具有统计学意义。实验结果一、肾组织病理HE染色显示UUO第七天肾小管明显扩张,肾间质中见大量炎症细胞浸润。二、模型大鼠肾组织ELMO1mRNA水平表达升高Real time PCR方法检测UUO第七天与sham组肾组织的ELMO1mRNA水平。结果显示：ELMO1的表达在两组间有统计学差异,采用两样本t检验,方差不齐(F=9.622,P=0.027),t=-7.356P=0.001,UUO组是Sham组的2.5+0.33倍。三、UUO模型大鼠肾组织ELMO、collagen Ⅰ及a-SMA蛋白水平表达升高,且ELMO1主要定位于肾小管上皮细胞中。Western blot方法检测UUO及Sham组大鼠肾组织的ELMO1、collagen Ⅰ、 α-SMA的表达。结果显示,ELMO1、collagen Ⅰ、α-SMA在各个组间差异有统计学意义。方差齐(ELMO1P=0.174;collagen Ⅰ P=0.167; α-SMA P=0.102),采用方差分析,ELMO1F=139.315, P<0.001; collagen Ⅰ F=21.052, P<0.001; α-SMAF=74.619,P<0.001。在UUO模型第三天ELMO1、collagen Ⅰ、 α-SMA与Sham组相比均升高,其中ELMO1是Sham组的3.1±0.33倍(P<0.001)；collagen Ⅰ是Sham组的1.7±0.54倍(P<0.05)；α-SMA是Sham组的19.8±1.88(P<0.001)。随着输尿管梗阻时间的延长,大鼠肾组织ELMO1蛋白的表达继续增高,在第7天即UUO模型组的ELMO1是Sham组的4.4±0.48倍(P<0.001)；collagen Ⅰ是Sham组的2.0±0.33倍(P<0.05)；α-SMA是Sham组的19.9±2.40(P<0.001)。在第十四天,ELMO1、collagen Ⅰ和α-SMA继续升高,ELMO1是Sham组的8.3±0.67倍(P<0.001)；collagen Ⅰ是Sham组的3.2±0.30倍(P<0.001)；α-SMA是Sham组的23.7+2.75(P<0.001)。免疫组织化学结果也显示,UUO组第7天ELMO1的表达高于Sham组,且ELMO1大多定位于近端肾小管细胞中。四、TGF-p1作用不同时间对NRK52E细胞ELMO1、Collagen1表达的影响用10ng/ml TGF-β刺激Oh、24h、48h、72h后提取总蛋白进行Western blot检测ELMO1和collagen Ⅰ。结果显示,ELMO1、collagen Ⅰ在不同时间点的表达差异有统计学意义。方差齐(ELMO1P=0.455; collagen Ⅰ P=0.495;),采用方差分析,ELMO1F=40.027, P<0.001; collagen Ⅰ F=176.200, P<0.001. TGF-β刺激24h与0h相比,ELMO1和collagen Ⅰ的表达均升高,,其中ELMO1是0h组的2.4±0.15倍(P<0.001)；collagen Ⅰ是Oh组的3.3±0.14倍(P<0.001)。TGF-β刺激48h与0h相比,ELMO1和collagen Ⅰ的表达仍升高,,其中ELMO1是0h组的2.4±0.26倍(P<0.001)；collagen Ⅰ是Oh组的3.6±0.26倍(P<0.001)。TGF-β刺激72h与Oh相比,ELMO1和collagen Ⅰ的表达仍然升高,,其中ELMO1是0h组的2.5±0.16倍(P<0.001)；collagen Ⅰ是Oh组的4.2±0.20倍(P<0.001)。五、不同浓度TGF-β1对NRK52E细胞ELMO1、Collagen1表达的影响用0、1、2、5、10ng/ml TGF-β刺激48h后提取总蛋白进行Western blot检测ELMO1和collagen Ⅰ。结果显示,ELMO1、collagen Ⅰ在不同浓度组建的表达差异有统计学意义。方差齐(ELMO1P=0.491; collagen Ⅰ P=0.516;),采用方差分析,ELMO1F=127.342, P<0.001; collagen Ⅰ F=96.221, P<0.001。TGF-β刺激1ng/ml与Ong/ml相比,ELMO1和collagen Ⅰ的表达均升高,,其中ELMO1是0ng/ml组的1.9±0.28倍(P<0.001)；collagen Ⅰ是0ng/ml组的1.7±0.15倍(P=0.008)。TGF-β刺激2ng/ml与0ng/ml相比,ELMO1和collagenⅠ的表达仍升高,,其中ELMOl是Oh组的3.7±0.11倍(P<0.001)；collagen Ⅰ是0ng/ml组的2.5±0.23倍(P<0.001)。TGF-β刺激5ng/ml与0ng/ml相比,ELMOl和collagen Ⅰ的表达仍然升高,其中ELMO1是0ng/ml组的3.9±0.30倍(P<0.001)；collagen I是Oh组的3.0±0.37倍(P<0.001)。TGF-β刺激10ng/ml与0ng/ml相比,ELMO1和collagen Ⅰ的表达仍然升高,其中ELMO1是0ng/ml组的4.0±0.17倍(P<0.001)；collagen Ⅰ是Oh组的4.5±0.25倍(P<0.001)。六、TGF-β1作用不同时间对NRK52E细胞ELMO1mRNA表达的影响用10ng/ml TGF-β刺激0、1、2、3、6、12、24、36小时后提取RNA进行real timePCR检测ELMO1mRNA。结果显示,ELMOl mRNA不同时间点的表达差异有统计学意义。方差齐(ELMO1P=0.109),采用方差分析,ELMO1F=74.994, P<0.001。TGF-β刺激1、2h与0h相比,ELMOl mRNA无统计学差异。TGF-β刺激3h与0h相比,其中ELMO1是0h组的1.7±0.15倍(P<0.001)。TGF-β刺激6h与0h相比,ELMO1的表达继续升高,,其中ELMO1是0h组的2.3±0.20倍(P<0.001)。TGF-p刺激12h与0h相比,ELMO1仍然升高,,其中ELMO1是0h组的3.7±0.15倍(P<0.001)。TGF-β刺激24、36h,ELMO1显著下降,与0h相比,无统计学差异。七、过表达ELMO1对于Collagen I的表达的影响在NRK52E细胞中过表达ELMO1,分别在pcDNA3.1转染的(N)的和过表达ELMO1(ELMO1-wt)的细胞中加或不加10ng/ml的TGF-β刺激48h。结果在各组间ELMO1、collagen Ⅰ的表达差异有统计学意义。方差齐(ELMO1P=0.108; collagen Ⅰ P=0.052;),采用方差分析,ELMO1F=43.255, P<0.001;collagen Ⅰ F=100.333, P<0.001。ELMO1-wt组与N组相比,其中ELMO1的表达是N组的9.5±1.35倍(P<0.001),说明过表达ELMO1是成功的,collagenⅠ表达水平与N组相比差异无统计学意义(P=0.092),表明单纯过表达ELMO1,并不能引起collagen Ⅰ的升高。N+TGF-β组的collagen Ⅰ的表达是ctrl组的4.6±0.83倍(P<0.001)；而ELMO1-wt+TGF-β组是N组的9.5±0.93倍(P<0.001)。这表明过表达ELMO1能进一步促进TGF-β引起的collagen Ⅰ的表达。八、ELMO1siRNA对于Collagen Ⅰ的表达的影响在NRK52E细胞中沉默ELMO1,,分别向ELMO1siRNA的细胞或阴性对照细胞(NC siRNA)的细胞中加或不加10ng/ml的TGF-β刺激48h。结果在各组间ELMO1、collagen Ⅰ的表达差异有统计学意义。方差齐(ELMO1P=0.346; collagen Ⅰ P=0.082;),采用方差分析,ELMO1F=71.620, P<0.001; collagen Ⅰ F=68.057, P<0.001。ELMO1siRNA组+TGF-β1与NC siRNA+TGF-β1组相比,其中ELMO1的表达是NC siRNA+TGF-β1组的0.49倍(P<0.001),说明ELMO1沉默是有效的,collagen Ⅰ表达水平与NC siRNA+TGF-β1组组相比差异有统计学意义(P=0.001), collagen Ⅰ的表达是NC siRNA+TGF-β1组的0.53倍,表明沉默ELMO1,能抑制TGF-β诱导的collagen Ⅰ的升高。九、过表达ELMO1对Rac1活性的影响在NRK52E细胞中过表达ELMO1,过表达ELMO1(ELMO1-wt)的细胞或空载体转染的对照细胞(N)培养48h后检测Rac1活性。。应用pull down及western blot方法检测NRK52E细胞Rac1的活性的改变。结果见,ELMO1的表达在两组间有统计学差异,采用两样本t检验,方差齐(F=5.781,P=0.074),t=-5.324P<0.05,ELMO1-wt组是N组的4.4±1.11倍。说明过表达ELMO1是成功的。Rac1的活性在两组间有统计学差异,采用两样本t检验,方差齐(F=7.268,P=0.054),t=-5.790,P<0.05,ELMO1-wt组是N组的3.5±0.75倍。这表明ELMO1在NRK52E细胞中过表达ELMO1可诱导Rac1的活化。十、沉默ELMO1对Rac1活性的影响在NRK52E细胞中用ELMO1siRNA沉默ELMO1, ELMO1siRNA的细胞或阴性对照细胞(NC siRNA)中培养48h后检测Rac1活性。应用pull down及western blot方法检测NRK52E细胞Rac1的活性的改变。结果显示,ELMO1的表达在两组间有统计学差异,采用两样本t检验,方差齐(F=1.467,P=0.292),t=10.290, P<0.05, ELMO1siRNA组与NC siRNA比较下降了53.2%。说明ELMO1siRNA是有效的的。Racl的活性在两组间有统计学差异,采用两样本t检验,方差不齐(F=0.738,P=0.439),t=10.735P<0.05,ELMO1siRNA组与NC siRNA比较下降了66%。这表明沉默ELMO1能抑制活化Rac1结论一、本研究成功建立了在肾间质纤维化模型UUO大鼠模型。二、发现ELMO1在UUO大鼠肾组织表达明显升高。并且主要定位于肾小管上皮细胞三、TGF-β1诱导肾小管上皮细胞表达ELMO1四、TGF-β1诱导肾小管上皮细胞Rac1活化五、ELMO1促进了Rac1的活化六、ELMO1促进了TGF-β诱导collagen Ⅰ的合成。