【研究背景】截至2015年,在中国范围内胃癌的发生率和死亡率都位居前五,表明胃癌依然是一个严峻的影响人民生命健康的因素。目前胃癌的免疫治疗得到了快速发展,并且也取得了一定的临床治疗效果,但是依然没有达到人们所预期的效果,这可能还有其他的因素干扰了免疫治疗。幽门螺杆菌感染是胃癌发生发展的一个关键因素,其中主要发挥致癌作用的是细胞毒素相关抗原(CagA)蛋白,是HP通过特异性IV型分泌系统分泌至细胞中。研究表明CagA可以引起KLF4在胃癌中的低表达,并且其机制研究表明CagA可以通过KLF4启动子区的甲基化,以及MIR155途径导致KLF4的表达沉寂或失活。KLF4是一个含有锌指结构的转录因子,研究已经表明KLF4在胃癌中起到抑癌基因的作用,并且已被证实,研究其失活机制对于胃癌治疗至关重要。我们课题组前期主要研究了CagA导致KLF4失活的机制,那么抑癌蛋白KLF4的低表达或丢失与促进胃癌发展之间的具体机制是什么呢?CXCL8是趋化因子家族的一种细胞因子,与特异性受体结合发挥作用,参与多种炎症反应,主要由单核-巨噬细胞分泌。研究表明HP胃黏膜上皮细胞24h后全基因组中CXCL8是唯一一个上调最显著的基因,CXCL8也是HP感染诱导产生的非常重要的炎症趋化因子。在胃癌中,CXCL8与其受体CXCR1和CXCR2结合发挥生物学功能。有研究发现,CXCL8通过与细胞表面的CXCR2受体结合趋化骨髓来源的抑制细胞(myeloid-derived suppressor cells,MDSCs)到达肿瘤局部并扩增,而MDSCs可以经多重机制来抑制T细胞的活化和应答,产生抗肿瘤免疫反应。而应用抗CXCR2单克隆抗体阻断MDSCs趋化至肿瘤局部显著增强抗PD-1免疫检查点阻断治疗效果。因此,如何有效抑制和阻断CXCL8在胃癌中的高表达,打破局部不良的免疫抑制微环境,是提高胃癌免疫综合治疗效果的重要环节。生物信息学分析发现在CXCL8基因启动子区紧邻TATA盒含有两个KLF4潜在结合位点,预实验结果表明KLF4表达载体共转染CXCL8基因启动子荧光素酶报告基因能强烈抑制基因启动子荧光素活性。由此做出猜想,HP感染使得炎症因子CXCL8上调是否与KLF4下调有关,即在胃癌中持续的HP感染导致KLF4的下调进一步引起CXCL8上调,从而诱导肿瘤局部免疫抑制微环境,促进胃癌的进展。设计以下实验方法来检测假说。【研究方法】1.用组织芯片来检测胃癌病人的癌旁和癌组织中CXCL8和KLF4的表达情况,并进行统计分析。2.GES-1,AGS,MGC803细胞转染CagA后,48h用q RT-PCR、ELISA检测CXCL8RNA和蛋白水平的表达。3.GES-1,AGS,MGC80细胞与幽门螺杆菌按照25:1,50:1,100:1(MOI:H.pylori:cell)感染复数共培养,48h后用q RT-PCR、ELISA检测CXCL8表达。4.AGS,MGC-803细胞转染不同剂量的KLF4后,48h后用q RT-PCR、ELISA检测CXCL8表达。5.GES-1,AGS细胞转染KLF4 Si RNA后,用q RT-PCR、ELISA检测CXCL8的表达。6.构建CXCL8启动子报告基因质粒(WT),及其突变体报告基因质粒(Site1,Site,Double site)。将构建的质粒分别与KLF4表达载体质粒,mini-TK质粒共转染,用双荧光素酶报告基因试剂盒检测CXCL8启动子报告质粒荧光素酶活性。7.CXCL8启动子报告基因质粒与CagA质粒、mini-TK质粒共转染,双荧光素酶报告基因试剂盒检测CXCL8启动子报告质粒荧光素酶活性。8.CXCL8启动子报告基因质粒与KLF4质粒、CagA质粒、mini-TK质粒共转染,双荧光素酶报告基因试剂盒检测CXCL8启动子报告质粒荧光素酶活性,看KLF4能否逆转CagA对CXCL8的调节作用,同样的也看CagA能否逆转KLF4对CXCL8的调节作用。9.利用CHIP试剂盒来检测KLF4是否与CXCL8启动子区结合。10.用不同浓度的CXCL8重组人蛋白分别短时间和长时间的处理GES-1,AGS细胞,WB检测KLF4的表达,同时选择一个最佳的浓度(3ng/m L)处理15天的细胞,检测CXCL8刺激对细胞增殖和迁移能力的影响。11.AGS,MGC803分别给与CXCL8重组蛋白单独刺激,和与KLF4表达载体共转染处理,检测细胞的增殖和迁移能力。13.构建用CXCL8重组蛋白30天慢性处理的MGC803细胞,检测其恶性行为学和增殖能力,并利用BALB/c裸鼠进行皮下成瘤实验,体内验证CXCL8对肿瘤生长的影响,以及对KLF4表达的影响。【研究结果】1.组织芯片检测发现胃癌病人的癌旁和癌组织中CXCL8和KLF4的表达呈负相关,并具有统计学意义。2.GES-1,AGS,MGC803细胞转染CagA后,48h用q RT-PCR、ELISA检测CXCL8在RNA和蛋白水平表达均升高。3.GES-1,AGS细胞和MGC-803细胞与幽门螺杆菌按照25:1,50:1,100:1感染复数共培养,48h后q RT-PCR、ELISA检测CXCL8蛋白和RNA表达水平都上调。4.AGS,MGC-803细胞转染不同剂量的KLF4后,48h后用q RT-PCR、ELISA检测CXCL8在RNA和蛋白水平都有不同程度的下调。5.GES-1,AGS细胞转染KLF4-Si RNA后,用q RT-PCR、ELISA检测CXCL8蛋白和RNA水平表达明显上调。6.CXCL8启动子报告基因质粒与KLF4质粒共转染GES-1细胞时,发现KLF4可以显著抑制CXCL8启动子活性,并且随着KLF4剂量的增加,其对CXCL8的抑制更明显,而CXCL8启动子突变体报告基因质粒与KLF4质粒共转染GES-1细胞时,KLF4对CXCL8的抑制作用消失。同样的结果在AGS细胞里得到。7.CXCL8启动子报告基因质粒与CagA质粒共转染GES-1/AGS细胞时,发现CagA可以显著上调CXCL8启动子活性。8.CXCL8启动子报告基因质粒与KLF4质粒、CagA质粒同时共转染GES-1细胞时,发现当CXCL8与KLF4剂量一定时,随着CagA剂量的增加,CagA可以逆转KLF4对CXCL8的负调节作用,同样的结果在AGS细胞里得到。当CXCL8与CagA剂量一定时,随着KLF4剂量的增加,KLF4可以逆转CagA对CXCL8的上调作用。9.AGS细胞中转染HA-KLF4质粒,染色质免疫共沉淀检测发现与对照组相比较,转染了HA-KLF4质粒组中CXCL8表达明显增强。10.用不同浓度的CXCL8重组人蛋白分别处理GES-1,AGS细胞后,可以发现随着CXCL8重组蛋白的增加KLF4的蛋白表达水平下降。并且慢性CXCL8处理的GES-1,AGS细胞的增殖和迁移能力明显增强。11.AGS,MGC803在给与CXCL8重组蛋白刺激后,细胞的增殖和迁移能力增强,但在给与CXCL8蛋白处理的同时转染KLF4表达载体,检测发现细胞的增殖和迁移能力明显降低。12.将构建好的CXCL8重组蛋白30天慢性处理的MGC803细胞,检测其恶性行为学和增殖能力增强,体内裸鼠成瘤实验显示CXCL8处理组的肿瘤生长更快,并且CXCL8处理组的肿瘤组织免疫组化结果显示KLF4蛋白表达下降,而Ki67蛋白表达增强。【结论】1.CXCL8与KLF4在胃癌组织中表达成负向相关。2.H.pylori感染或CagA基因转染上调CXCL8的表达。3.KLF4过表达可以抑制CXCL8表达,而KLF4-Si RNA转染可以上调CXCL8表达。4.双荧光素酶报告基因检测结果提示KLF4在转录水平上负调节CXCL8的表达。5.染色质免疫共沉淀实验结果发现KLF4能与CXCL8启动子区结合。6.通过体内体外实验可以验证CXCL8可以反过来抑制KLF4表达,并促进细胞增殖,迁移,促进肿瘤生长。