环境胁迫是作物维持产量的主要挑战之一,在高温、干旱或盐害等逆境下,活性氧(ROS)的稳态平衡会被扰乱,导致蛋白质等生物大分子氧化损伤。这些氧化损伤蛋白质的及时清除及细胞器内各蛋白质质量的控制是维护细胞正常结构、功能的重要条件。LON2蛋白酶是一种定位于过氧化物酶体的ATP依赖的丝氨酸类型蛋白酶,目前在拟南芥等模式植物中的研究表明,LON2蛋白酶与过氧化物酶体中蛋白质的转运和损伤、淘汰过氧化物酶体的自噬相关。尽管目前已知LON2蛋白酶可以对过氧化物酶体中的蛋白进行降解,但是关于其在调控ROS稳态和控制过氧化物酶体中氧化蛋白水平中的功能尚不明确,尤其是在应对逆境所引发的氧化胁迫下的作用机理未见报道。本研究从蓝莓(Vaccinium spp.)中分离了VcLON2 cDNA序列,并分析了蓝莓VcLON2的时空表达,再将ycLON2遗传转化本氏烟和对本氏烟NbLON2进行RNAi处理,结果表明LON2蛋白酶可以调控过氧化物酶体中与缓解氧化胁迫损伤相关的抗氧化酶活性。具体研究如下：从蓝莓中分离出VcLON2 cDNA序列,全长2667 bp,编码888个氨基酸,理论等电点pI为6.68,分子量为98.28 kDa。VcLON2的氨基酸序列中包含一个典型的C端过氧化物酶体定位信号(PTS1),与拟南芥LON2蛋白酶具有高度的同源性(氨基酸相似性84%)。qRT-PCR结果表明,在正常生长条件下,VcLoN2在蓝莓所有组织中都有表达,在衰老或过度成熟的器官中比幼嫩或未成熟的器官表达量更高;用NaCl、干旱和高温等逆境处理,蓝莓叶片中的VcLON2的表达量显著升高。表明VcLON2蛋白酶可能与植物衰老和抗逆相关。为了研究VcLON2蛋白酶在植物抗逆中的作用,通过将VcLON2遗传转化本氏烟,得到了VcLON2转化本氏烟抗性植株。在对照条件下,T1代VcLON2转化植株(P1、P2和P5)表型与WT无差异。但在NaCl(200 mM)、干旱(2%PEG6000)和高温(45℃,1.5 h)处理后,相较于WT,VcLON2转化植株的生物量生长降幅较小且叶片鲜绿,叶绿素含量是WT的2.40-3.07倍,而MDA和羰基化蛋白含量仅为WT的32.5%-75.2%,同时,VcLON2的过表达还普遍降低了H202含量,并增加了CAT、APX等抗氧化酶的蛋白活性。可见,逆境条件下,LON2蛋白酶对维护过氧化物酶体的结构和功能具有重要作用,其可以有效的清除过氧化物酶体中的氧化蛋白质,并在植物过氧化物酶体H202稳态的调节中具有重要的作用,作用机理可能是通过调节过氧化物酶体中抗氧化酶(CAT等)的活性和/或含量来进行的。将本氏烟中内源表达的与VcLON2高度同源的NbLON2进行RNAi沉默处理,可以作为验证VcLON2基因功能的辅助方法。在对照条件下,NbLON2 RNAi本氏烟植株(S4、S5和S6)的生长情况比WT稍弱,但生长参数均无显著差异。在NaCl(100mM)、干旱(1%PEG6000)和高温(45℃,1.0 h)处理后,相较于WT,NbLON2 RNAi抗性本氏烟植株明显黄化且生物量显著降低,其相对含水量也显著下降,在高温胁迫下高达19.29%-22.90%,而WT无显著变化或轻微下降；叶绿素的变化趋势也与其一致；MDA和羰基化蛋白在RNAi抗性植株中有比WT更多的积累量。同时NbLON2的沉默还显著增加了逆境下本氏烟中的H202含量,并降低了CAT的蛋白活性。上述结果表明,NbLON2的沉默显著降低了本氏烟对逆境的耐受性,并导致细胞中ROS和氧化产物积累,表明LON2蛋白酶在维持过氧化物酶体中ROS的稳态具有重要的作用。为进一步研究pull-down等互作技术筛选蓝莓过氧化物酶体中VcLON2蛋白酶的互作蛋白,在获得VcLON2全长cDNA的基础上,构建了融合表达载体VcLON2-pET3Oa(+),并对原核表达体系中的表达菌株和IPIG浓度进行了筛选,结果表明大肠杆菌表达菌株Rosetta(DE3)在0.5 mM IPTG下可有效诱导表达出大量融合蛋白；应用Ni2+柱进行亲和纯化其中的VcLON2,但纯度无法达到预期目标,需进一步优化实验条件。后续相关工作仍在进行中。