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RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术不仅可以用于昆虫基因功能的研究,还可以用于田间害虫的防治。V-ATP酶(vacular-type ATPase,V-ATPase)是生物体内普遍存在的一种酶,它是以水解ATP为能量跨膜转运H+的质子泵,为生物体保持正常的功能发挥着重要作用。对V-ATPase基因的任何干扰都会影响它的活性,进而影响生物的生存。U6启动子是介导小干扰RNA(small interference RNA,si RNA)表达的启动子,其驱动的短发夹RNA(short hairpin,shRNA)表达载体能在细胞内合成大量的siRNA,导致目的基因沉默。本研究利用染色体步移(Chromosome Walking)技术克隆得到东方粘虫(Mythimna separata)U6启动子序列,并通过生物信息学及细胞转染的方法对该序列进行分析和功能验证。该序列全长1 426 bp,包含八聚体序列(OCT),SPH元件,远端序列元件(DSE),近端序列元件(PSE)及TATAbox等RNA聚合酶Ⅲ启动子的特征元件。细胞转染表明该序列能成功驱动shRNA的表达,具有U6启动子活性。根据东方粘虫V-ATPase B亚基基因序列,设计并获得shRNA,将其与U6启动子构建到昆虫杆状病毒转移载体上,得到重组昆虫杆状病毒转移载体,并通过细胞转染的方式获得包含目的基因的昆虫杆状病毒。PCR及测序结果表明重组杆状病毒能够稳定遗传。通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测了重组杆状病毒对东方粘虫V-ATPase B亚基基因的影响。结果显示,B亚基基因相对表达量显著降低,表明重组杆状病毒能在东方粘虫体内繁殖并表达目的基因。本研究成功克隆了东方粘虫的U6启动子,并构建了由其驱动的昆虫杆状病毒表达载体,得到了具有沉默东方粘虫V-ATPase B亚基基因效应的杆状病毒,同时也证明了该杆状病毒具有遗传稳定性,为利用RNAi技术防治东方粘虫及其他害虫提供了参考。